1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

1 目前我国中药药渣资源处理和综合利用的现状

中药提取后药渣排放和处理是中药提取车间的棘手问题，出渣间高湿度，高污染，污水横流，霉迹斑驳。每个中药生产企业每天都要排出大量的药渣。这些药渣如果简单的堆放在外面，日积月累，堆积如山，渐渐地就会发酵霉烂，臭不可闻，污染环境，给周边群众的生产和生活造成危害［１］。制药行业产生的污染源很多，其中药渣是一个重要部分，已往对药渣的处理方法主要有填埋或焚烧等，这几年随着技术进步和良好药品生产规范意识的强化，一部分企业在新建或改造时很好地解决了出渣间污染的问题，另一部分企业则对药渣进行利用，变废为宝。其中有许多值得借鉴的经验，现分析如下。

（1）焚烧处理 （2）堆肥化处理 （3）用于食用菌生产 （4）加工成保健饲料 （5）用于育苗及栽培基质。

2 双向固态发酵工艺原理

双向发酵是20世纪90年代初庄毅教授等为了扩大槐耳菌质的适应症，独创的一项使用药用真菌与植物类药材有机结合的复合型中药生产工艺［2］。（发酵菌种）与具有一定活性成分的药材（药性基质）构成发酵组合，在特定条件下进行发酵，基质在提供真菌生长所需要营养的同时又能被真菌的酶改变组织，成分，从而产生新的性味功能的药性菌质（简称菌质），该药性菌质是人工制造的新药材［3］，”双向发酵”的特点是采用了药性基质，它实质上属生物技术”固体发酵工程”的高级阶段。

药用真菌在生长过程中会产生各种各样的酶，如纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶等。酶是一类具有高度催化效率的生物催化剂，它可以使复杂的化学反应在常温常压下迅速完成。丰富而强大的酶系可以将药物的成分分解转化形成新的活性成分，产生新的药效。采用具有活性成分的中药材作为基质被有益药用真菌发酵的新型双向发酵可通过以下机理来进行：

首先，药用真菌以中药中的有效成分为前提，经药用真菌的代谢形成新的化合物；

其次，药用真菌在生长过程中还能产生丰富的次生代谢产物，有些次生代谢产物自身就是功效良好的药物；

第三，药用真菌的次生代谢产物和中药中的某些物质发生化学反应生成新的化合物；

第四，由于中药的某些物质可能对药用真菌的生长和代谢有促进或抑制作用，对活性成分的产生也可能有促进或抑制作用，药用真菌在中药的特殊环境中也有可能改变自身的代谢途径，从而形成新的活性成分或改变各活性成分的相互比例；

最后, 药用真菌的分解作用有可能将中药中的有毒物质进行分解, 从而降低药物的毒副作用, 如雷公藤经微生物发酵后可以脱去有毒物质。利用药用真菌的生长代谢来炮制中药, 可以比一般的物理或化学的炮制手段更具优越性, 可较大幅度地改变药性, 提高疗效, 降低毒副作用, 扩大适应症。

双向发酵创建十余年来，已证明其增效，扩用，解毒的作用。本研究在此基础上，运用双向发酵原理，以课题组现有的高性能灵芝菌为研究对象，以中山制药的玄七通痹胶囊等企业生产的多种药渣为基质，构建高效的灵芝菌-中药渣双向发酵体系。研究发酵产物中多糖、萜类、核（皂）苷、甾醇类等活性物质的检测方法和提取技术；通过对活性物质的检测，研究不同的发酵培养基组成及发酵条件对双向发酵的影响，为构建高效的双向发酵体系奠定基础。

3 灵芝菌简介

灵芝(ganoderma lucidun)别名赤芝、红芝，属于真菌界(Mycota)，真核真菌亚界(Eukaryomycota)，真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes) , 非褶菌目(ApHyllophorales)，灵芝菌科(Ganodermataceae)，灵芝属(Ganoderma)［4］。

灵芝是一种营养和保健价值极高的大型担子菌，作为我国传统的药用真菌有着悠久的应用历史。最早的药学专著《神农本草经》称：灵芝”久味苦平，主治胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘，久服轻身不老”；李时珍在《本草纲目》中也详尽记述到：赤芝，苦平无毒，主治胸中结、益心气、补中、增智慧、不忘；紫芝，甘温无毒，好颜色、治虚劳、治痔［5］。2000年版的《中华人民共和国药典》［6］把赤芝与紫芝的干燥子实体收录为新增中药材品种，灵芝的药用价值首次得到官方正式认可。

本世纪50年代末期以来，由于人工栽培灵芝子实体成功，开始大规模生产，以供药用。随着深层发酵培养灵芝菌丝技术的发展，灵芝的开发应用日益广泛。80年代以来，对灵芝类真菌的化学成分、药理作用和作用机制以及临床应用进行了大量的研究，并取得了重大的进展，为灵芝的临床应用奠定了理论基础。

4 灵芝发酵体系中的活性成分及提取鉴定工艺

4.1灵芝多糖

灵芝多糖是灵芝水提物中主要药理活性成分之一。

4.1.1灵芝多糖特点

灵芝多糖的种类较多，目前分离到的有200多种，大部分为β#8212;构型的聚糖，少数为α#8212;型的聚糖。多糖链由三股单糖链构成，是一种螺旋状立体构型物，其立体构型和DNA、RNA相似，螺旋层之间主要以氢键固定定位，分子量从数百到数十万，大多数存在于细胞壁内壁，在液体培养的发酵液和固体培养的培养基中有灵芝菌丝分泌的胞外多糖。

灵芝多糖是由肽多糖、葡萄糖、杂多糖等多糖组成的混合物。从构成来看，灵芝多糖大多为杂多糖，即除葡萄糖基外，还含有少量D-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等单糖［7］（灵芝多糖的单糖组成见表1-1）。单糖间糖苷键连接方式有β(1→3)(1→6)，或β(1→4)(1→6)，或含有肽链组成的，而一般多糖不具有这一性质［8］。另外多数灵芝多糖有分支，有研究表明灵芝多糖主链越长，侧链频率越高，分子量越大，生物活性越高［9］。

表 1-1 灵芝多糖的单糖组成(摩尔比)［10］

Table 1-1 Sugar composition of polysaccharide from Ganoderma lucidum(mol.%)

样 品	葡萄糖	半乳糖	甘露糖	木糖	阿拉伯糖	岩藻糖	鼠李糖
菌丝体多糖	5.35	2.67	1.00	1.19	#8212;	0.38	0.37
子实体多糖	5.82	2.23	1.00	1.35	0.72	#8212;	0.51

4.1.2灵芝多糖提取工艺

灵芝多糖（GLP）微溶于水，在热水中溶解度较大，不溶于乙醇等有机溶剂，其传统提取方法主要有热水浸提法、乙醇提取、酶提取、稀碱提取法或稀盐提取法等，较新的分离技术有超声波法、超临界CO2萃取法，对微量成分、结构性质相似成分用色谱分离法，包括吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法和高效液相色谱法等。大量实验结果表明：同一原料提取方法不同，多糖提取率、多糖含量、生物活性均有不同［11］。

一般灵芝多糖的提取工艺为:

┌→滤液 ┌→滤渣

原料脱脂、脱低聚糖#8212;┴→滤渣→加水提取#8212;┴→提取液→浓缩、乙醇沉淀→粗多糖→脱色、脱蛋白→脱蛋白粗多糖→50%酒精沉淀→精密分析

子实体或菌丝体脱脂一般采用乙醇、甲醇等有机溶剂，在脱脂同时还可以使分解多糖的糖苷酶失活；粗多糖中蛋白质的脱除常用Sevage法、蛋白酶法或者其他结合法；脱色可用活性炭吸附、离子交换树脂处理或双氧水处理。

4.1.3灵芝多糖鉴定

灵芝多糖含量测定方法主要有苯酚#8211;硫酸法、蒽酮#8211;硫酸法、地衣酚比色法［12］ ，本实验拟用DNS法进行测定。

4.2灵芝三萜类化合物

三萜类化合物是从灵芝中分离得到的另一类具有生物活性的主要有效成分。

4.2.1灵芝三萜类的特点

现已分离的灵芝三萜类化合物有130种，主要分为四环三萜和五环三萜（一般将含有羧基的三萜类物质称为灵芝酸）。从灵芝四环三萜类化合物的结构来看，属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物。按分子所含碳原子数可分为C30、C27、和C24三大类，根据其所含功能团和不同的侧链可有6种基本骨架［13］。

在三萜类化合物的结构中，环上的双键大多位于△8(9)位，在C11位和C23位大部分有羰基，而且在C3、C7、C11位也多被羟基或羰基所取代。在三萜醇、醛和过氧化物的结构中环上大多存在两个不饱和双键，其位置在△7(8)、△9(11)位。C11位和C23位也不存在羰基而且环上的取代基明显减少。

4.2.2灵芝三萜类的提取工艺

灵芝中三萜类化合物的提取分离方法可以分为三类，一类是用甲醇或者乙醇提取原料，提取物直接进行层析分离；第二类方法是用甲醇、乙醇等为溶剂提取，提取物经碱处理分出总酸部分再进行分离；第三类方法是利用制备衍生物的方法进行分离，即先用乙醚提取，其总酸部分用重氮甲烷甲基化，然后再分离［14-15］。四是先用乙醇提取菌丝体，再用氯仿萃取，碳酸氢钠除杂质的方法来进行分离，具体步骤如下:

热风干燥菌丝体→称取10g→加入20倍(v/w)的50%乙醇→混合过滤→滤液减压蒸馏→加入50mL水→50mL氯仿萃取→加入5%碳酸氢钠50mL抽提→取水相加入2N盐酸调pH为3→加入氯仿萃取→减压→得总灵芝酸［16］。

4.2.3灵芝三萜类的分离鉴定

灵芝中三萜化合物的分离大多是经过反复硅胶柱层析，较纯的部分采用薄层、低压柱，高效液相色谱(正反相)制备等方法进行分离纯化。硅胶柱色谱一般常用的展开剂（流动相）为MeOH-CHCl3，EtAc-C6H6, EtOAc-acetone，EtOAc-CHCl3，CHCl3-McOH-H2O等系统。HPLC多用乙睛-乙酸胺溶液以及McOH-H2O洗脱。薄层检查一般使用的展开剂为CHCl3-MeOH (95:5, 9:1V/V)或苯-乙酸乙醋(3:7 V/V)，香兰醛-硫酸作为薄层斑点的显色剂［15］。

4.3灵芝核（皂）苷类化合物

核（皂）苷类化合物也是从灵芝中分离得到一类具有生物活性的主要有效成分。

4.3.1灵芝核（皂）苷类化合物的特点

中草药有效成分中所含的生物皂苷等有免疫刺激作用 ,能促进机体产生抗体 ,可明显增加抗体形成细胞数和溶血测定值 ,提高血清 IgA、IgM、IgG水平 ,明显增强抗体分泌细胞及 T、B 淋巴细胞、NK细胞活性［17］。

4.3.2灵芝核（皂）苷类化合物提取工艺［18］

分别称取 4 种发酵配方芝芪菌质 10g, 加 10倍量水 ,浸泡 30min, 加热回流提取 2 次 ,1.5h/ 次(第 1 次 10倍量水 ,第 2 次 8 倍量水) ,抽滤 ,合并滤液 ,浓缩至含菌质 1g/ml, 醇沉 ,上清液用旋转蒸发仪挥发至无醇味 ,用水饱和的正丁醇萃取总皂苷(萃取 4 次 ,每次 20ml ) ,合并正丁醇液 ,以1%NaOH 溶液洗 2 次 (每次 60ml ) ,继续用正丁醇饱和的水(每次 60ml ) 洗至中性 ,蒸干正丁醇层。

4.3.3灵芝核（皂）苷类化合物鉴定

拟采用分光光度法进行测定，先进行标准曲线的绘制，再进行化合物的测定。

4.4灵芝甾醇类化合物

灵芝甾醇类化合物也在发酵液中有一定的含量。

4.4.1灵芝甾醇类的特点

植物甾醇对人体具有较强的抗炎症作用。能够抑制人体对胆固醇的吸收，促进胆固醇的降解代谢等作用［19］。

4.4.2灵芝甾醇类的提纯

先用一定浓度的氯仿进行提取。

4.4.3灵芝甾醇类的鉴定

方法一：COI/T.20/Doc.no.10/Rev.1气相色谱法测定甾醇组成及甾醇含量［20］。

方法二：ISO 12228：2008 动植物油脂甾醇组成和甾醇总量的测定气相色谱法［21］。

5 灵芝发酵液提取物的生理学作用

⑴ 保肝作用和排毒作用

Hirotani等［22］的药理学实验认为灵芝中的灵芝酸提取物能增强肝功能，加强其解毒作用，能降低由CCl4引起的血清中转氨酶水平的提高；促进肝炎小鼠肝再生，增强小鼠对毛地黄苷的抵抗作用，它也能降低甘油三酯的合成。他们还发现了灵芝酸R和S能强烈抗半乳糖胺引起的肝中毒。

Wang等［23］从赤芝子实体中得到粗组分GT，进一步通过硅胶柱色谱得5个组分(GT1-GT5),经HPLC检测证实该GT和GT2主要含灵芝酸A和赤芝酸A(lucidenic acid A)。实验表明GT和GT3对四氯化碳、氨基半乳糖苷和卡介苗 脂多糖所致的3种肝损伤模型小鼠有较好的保肝作用，可明显降低模型动物的血清ALT和肝脏TG含量，并不同程度减轻动物肝损伤。在小鼠免疫性肝损伤(BCG LPS)原代肝细胞体外培养实验中，作者观察到GT(0.5，5.0，50，100μg/mL)和GT2(0.5，2.0，10，50μg/mL)可不同程度地降低损伤肝细胞上清液ALT活性和NO含量，与阳性对照药马洛替酯(malotilate)作用相似。

⑵ 抗肿瘤作用

Gao等［24］从灵芝子实体中分离出十种羊毛甾烷型三萜类化合物，药理学实验证实，lucialdehydes B,lucialdehydes C,ganodermanonol和ganodermanondiol对Lewis型肺癌细胞(LLC)、T- 47D细胞以及恶性毒瘤S180细胞具有细胞毒作用；其中lucialdehydes C对LLC，T-47D，S180细胞和Meth-A肉瘤细胞的杀伤力最强，半数有效剂量分别为10.7、4.7、7.1和3.8μΜ［25］。Wu等［26］从灵芝子实体乙醇提取液分离出六种三萜类化合物，药理学实验表明，lucidenic acid N, lucidenic acid A和灵芝酸(ganoderic acid)E对肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15及肿瘤细胞P-338具有显著的细胞毒作用。

⑶ 抑制胆固醇合成

Komoda ［27］等报道，以大鼠肝细胞离心得到的亚细胞上清液为体外反应体系，发现羊毛甾醇类衍生物7-酮一羊毛甾-8-烯-3β,15α-二醇和羊毛甾-7-烯-3β均可抑制由羊毛甾或24,25-二羟基羊毛甾至胆固醇的生物合成。Komoda ［27］等认为C-7位羰基或C-15α位羟基是抑制胆固醇的必须基团。Shiao［28］等在大鼠的高胆固醇饲料中加入灵芝的菌丝体，可显著降低血清和肝脏中胆固醇和甘油三酯的含量，并指出其有效成分是三萜类，主要是ganodermicacid R和S，可在肠道竞争性抑制外源性胆固醇的吸收。目前研究认为，灵芝中的氧化三萜类化学结构与哺乳动物胆固醇生物合成途径中羊毛甾醇的中间体类似，可抑制胃肠道吸收食物中的胆固醇。这些氧化三萜类还抑制胆固醇合成过程中的限速酶#8212;#8212;3-羟-3-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶，并因此抑制胆固醇合成。

⑷ 降血压活性

Moirgiwa等［29］在研究降血压药物时发现，灵芝子实体70%的乙醇提取物具有抑制血管紧张肽转化酶活性的作用。他们从上述提取物中分离并鉴定出5种新的具有羊毛甾烷骨架的三萜化合物包括起主要作用的灵芝酸Y，H，F，B和D。

⑸其它药理作用

灵芝酸S和lucidenolactone能刺激和抑制凝血［30-32］；ganoderiol F，ganodermanondiol和ganodermanontiol对体液免疫功能具有促进作用［33］；灵芝三萜类化合物ganoderic acids A, B, G和H都有抗伤害性感受效应，其中以ganoderic acids H的效果最好等［34］。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

一、本课题要研究或解决的问题

1．灵芝菌－中药渣双向发酵产物活性物质的提取

通过水提、醇提等方法，建立多糖、三萜类、核（皂）苷及甾醇类等活性物质的提取方法。