1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

青霉素酰化酶(penicillin acylase，EC3.5.1.11)又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶，是β-内酰胺抗生素酰基转移酶家族的一个亚类。该酶为可逆酶，一般在酸性或中性条件下可以催化6-氨基青酶烷酸(6-APA)[1]、7-氨基脱乙酰头孢烷酸(7-ADCA)母核和酰基侧链发生酰基化反应制备半合成抗生素[2]；而在偏碱性条件下可以催化青霉素和头孢菌素水解成为6-APA和7-ADCA，它们是制备半合成β-内酰胺抗生素所需的关键中间体。因此，青霉素酰化酶在医药工业中扮演了极为重要的角色，在生产新型抗生素方面有着较高的应用价值，本课题的主要研究目的，就是筛选获得一株青霉素酰化酶，并对其编码基因进行克隆表达。

1.1青霉素酰化酶的来源及分类

青霉素酰化酶最初是从黄青霉Q176 (Penicillium shrysogenum)和米曲霉(Aspergiluus oryzae)中分离得到的[3]。如今已在多种微生物中发现有青霉素酰化酶的存在，如细菌、放线菌、真菌、酵母等[4-5]。产生青霉素酰化酶的细菌有很多，可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。前者通常产生的是胞外酶，存在于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)[6]和粘节杆菌(Arthrobacter viscosus)[7]等；而革兰氏阴性菌则是胞内酶，存在于大肠杆菌(Escherichia coli)[8]、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)[9]、无色杆菌木糖氧化属(Achromobacter xylosoxidans)[10]、嗜柠檬酸克吕沃氏菌(Kluyvera citrophila)[11]、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)[12]和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[13]等。

青霉素酰化酶根据催化底物的优先性不同，可分为三类，如表1-1所示。

表1-1 青霉素酰化酶的类型

Tab. 1-1 The type of penicillin acylase

类型	催化底物	底物结构式
青霉素G酰化酶	青霉素G
青霉素V酰化酶	青霉素V
氨苄青霉素酰化酶	氨苄青霉素

1.2 青霉素酰化酶的表达

重组青霉素酰化酶在大肠杆菌中主要是分泌型表达，前体肽从胞内分泌到周质空间，在周质里折叠成成熟的蛋白。由于整个成熟过程较为复杂，所以在表达过程中极易形成包涵体，从而影响表达水平[14]。

目前青霉素酰化酶的表达主要存在以下两个瓶颈：1、过量表达的前体蛋白不能及时正确折叠，从而形成大量包涵体，而形成的包涵体会阻塞蛋白转运通路，从而积累更多包涵体；2、蛋白过表达会产生极大的机体和代谢负担，尤其是错误折叠的包涵体积累，会引起细胞一系列消极反馈，如生长抑制，细胞溶解，甚至死亡，最终也会影响重组蛋白的表达水平[15]。

所以寻找一种有效的表达策略，提高青霉素酰化酶的表达水平是尤为重要和迫切的。

1.2.1 青霉素酰化酶的成熟途径

青霉素酰化酶的成熟途径：转录 翻译 前体蛋白preproPAC

信号肽将preproPAC转运至周质空间 信号肽被切除，形成proPAC

在连接肽和β亚基处，分子内自动水解，形成α亚基 连接肽和β亚基两部分

周质中蛋白酶水解连接肽，α、β亚基正确折叠成成熟PAC[16]。

图1-6显示了青霉素酰化酶在大肠埃希氏菌细胞中的成熟过程

图1-6 成熟青霉素酰化酶在大肠埃希氏菌细胞中的加工[13]

Fig. 1-6 Synthesis and maturation of penicillin acylase in E.coli

1.2.2 青霉素酰化酶表达的影响因素

(1)外在因素

温度： 一般来讲，培养温度对产酶的影响具有普遍性，温度影响着蛋白的翻译和分泌速度，分泌速度又与蛋白能否正确折叠有关，受转录水平的影响较小。

(2)内在因素

转录水平： 质粒的拷贝数和启动子的强弱会影响转录水平，一般选择较强的lac和T7启动子来提高转录水平，但启动子太强，在用IPTG诱导表达的时候，经常会形成包涵体，主要是由于转录太快，前体肽不能及时转运至周质空间，打破了蛋白转运通路的平衡。

翻译水平：一般不同来源的重组蛋白在大肠杆菌中表达时，很少在翻译水平上存在限制，因为原核细胞中核糖体丰富，而且原核细胞由于没有核膜的阻断,可以边转录边翻译。

折叠过程：当信号肽被切除，在周质空间形成proPAC，连接肽的分子内自动水解为主要限速步，错误折叠会造成包涵体的积累，导致细胞溶解，甚至死亡。

1.2.3 青霉素酰化酶高效表达的策略

(1)诱导培养基优化

Ca2 的添加：Kasche[16]等发现每个青霉素酰化酶分子中都紧紧结合了一个Ca2 ，尽管Ca2 不直接参与酶分子的功能，但Ca2 在青霉素酰化酶成熟过程中是必须的，在加入少量Ca2 后，青霉素酰化酶的表达量能有效增加。Ignatova[17]等也发现Ca2 的添加能潜在促进青霉素酰化酶在周质空间的后加工过程。

(2)促进酶分子折叠

分子伴侣共表达：Lin[18]等发现了一种热休克蛋白DegP（拥有蛋白酶和分子伴侣特性），将其与E.coli来源的青霉素酰化酶共表达，尽管DegP在蛋白成熟过程中并不是必须的，但结果表明DegP能有效帮助青霉素酰化酶折叠，并减少包涵体的形成，细胞代谢压力也明显改善。

(3)改善转录水平

去除信号肽表达：Xu[19]等切除了E.coli来源的青霉素酰化酶自身的信号肽，使其在E.coli工程菌细胞质中表达，结果表明前体蛋白proPAC大量形成包涵体，在共表达了细胞质分子伴侣DnaK/J-GrpE和trigger因子后，表达效果明显提高。

启动子和诱导剂：Narayanan[20]等尝试了araB启动子、trc启动子和T7启动子，并使用不同诱导剂进行诱导，结果表明在araB启动子使用阿拉伯糖进行诱导时，也会出现T7启动子-IPTG诱导时的问题，即产生大量包涵体，但发现使用阿拉伯糖诱导T7启动子时，表达情况较好，可能是由于阿拉伯糖既可以作为碳源，也可以作为诱导剂，但诱导强度比IPTG弱，所以转录速度较慢，正确折叠的蛋白增多。

(4)分泌水平改变

提高分泌水平：Chou[21]等发现Sec途径中的SecB蛋白能有效促进青霉素酰化酶的表达，当青霉素酰化酶在一株SecB突变菌中表达时（缺少SecB蛋白），表达水平明显降低。可是发现当SecB蛋白过量表达时，可溶的与不可溶的PGA前体肽都得到增加，结果显示SecB只能通过调节前体肽的稳定性，潜在提高分泌水平，并不能解决青霉素酰化酶的表达瓶颈。

胞外分泌表达：理论上，胞外分泌表达可以显著提高青霉素酰化酶表达水平，解决包涵体等一系列问题，因为：1、PGA已经分泌到周质空间，只需要再穿过一层外膜就能分泌到胞外；2、PGA的胞外分泌能减少由于错误折叠而在周质积累的proPGA所造成的机体负担。Ignatova Z[20]等发现通过共表达kill基因，PGA能分泌到胞外，但是细胞生长却被严重抑制，细胞活性降低；Lin[13]等通过共表达了BRP基因，也出现了类似的情况，只有40%的PGA能被分泌到胞外，但细胞被严重破坏。Gumpert J[14]等找到了一种很有效的方法，使PGA既能分泌到胞外，机体影响也降到最低。通过将PGA在一株大肠杆菌突变菌中表达(部分脂蛋白缺失），PGA能很有效的分泌到胞外，分泌量达到90%。图1-7显示了提高青霉素酰化酶表达的一些策略。

图1-7 青霉素酰化酶在大肠杆菌中表达的一些策略[16]

Fig. 1-7 Genetic strategies for enhancing the production of PGA in E.coli

(5)结论

到目前为止，各种来源的青霉素酰化酶都成功在大肠杆菌中异源表达，正确折叠的有活性的青霉素酰化酶主要集中在周质空间，胞外几乎没有酶活。青霉素酰化酶的表达水平普遍较低，主要是由于青霉素酰化酶成熟途径复杂，容易形成包涵体影响表达水平。Cheng[15]等通过使用糊精作为唯一碳源，已经成功实现了AfPGA的高效表达；Yong Wen[16]等通过使用TB培养基代替普通LB培养基，实现了KcPGA的高效表达。虽然目前许多研究工作中通过一些策略，使青霉素酰化酶的表达水平有所提升，但并未有效解决包涵体等表达瓶颈，往往是通过发酵罐发酵，在高浓度菌体量的条件下才能获得少量的青霉素酰化酶，单位菌体产酶量仍然较低。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

青霉素酰化酶具有良好的催化酰化/去酰化特性，因此在医药工业中发挥着重要的作用，主要应用于半合成青霉素和头孢菌素类的工业生产，可以催化制备高效、广谱、适用于不同用途的新型β-内酰胺抗生素。尽管青霉素酰化酶的研究以开展多年并取得重要进展，但基础性的深入研究和大规模工业生产应用所需的优良酶类仍然缺乏，因此筛选性能更优越的青霉素酰化酶产生菌对酶法合成β-内酰胺类抗生素具有重要意义。

本课题主要研究内容：

1. 将实验前期获得的一段编码青霉素酰化酶的基因进行改造，替换原有信号肽为大肠杆菌常用信号肽pelb, 并构建表达载体pet22b/pelb-pgapx04，将其导入大肠杆菌宿主bl21中。