1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1.DHA概述

1.1 DHA简介

DHA（Docosahexaenoic acid）又名二十二碳六烯酸，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸。DHA是一种功能性脂肪酸，它是人体大脑细胞的重要组成成分，占大脑脂肪酸的25%～33%，在胎儿及婴幼儿大脑和视觉系统发育过程中占有十分重要的地位，还能有效防止老年痴呆症，被称为”高智商因子”、”脑黄金”^[1]。DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主要元素，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%^[2]。

图1 DHA分子结构式

1.2 DHA生理功能

二十二碳六烯酸（DHA）具有多种重要的生理功能：

1）调节中枢神经系统

DHA主要分布在大脑灰质和视网膜中，约占大脑灰质结构脂质的30%，它对婴儿大脑的正常发育和成人的大脑功能的正常发挥有非常重要的作用^[2]。

2）预防和治疗心血管疾病

DHA可降低血液中的胆固醇、甘油三酯、极密度脂蛋白、低密度脂蛋白、而且增加高密度脂蛋白含量，将多余的胆固醇等物质由血液运回肝脏代谢，从而防止患心血管疾病的发生^[3]。

3）调节视觉神经系统

DHA是视网膜组织中的重要组成成分，它不规则地分布于视杆细胞外围感光部分的磷脂酞乙醇胺、磷脂酞丝氨酸中，约占其中总脂肪酸的30-40%,如果饮食中缺乏DHA，则可使视网膜组织中的DHA含量下降，导致视网膜电图失常，DHA对婴幼儿的视觉发育、视觉功能的正常发挥有着非常重要的作用^[4]。

4）抗癌及提高免疫力等作用

DHA的抗肿瘤的机制也是通过抑制AA的代谢而发挥作用的，可用于抗恶性肿瘤如乳腺癌，胃癌，膀胱癌，以及子宫癌等病人的辅助药物，能明显抑制肿瘤的生长，成长和转移速率^[5]。

1.3 DHA应用

DHA主要应用在以下几个方面:^[6]

1）医药用品

由于DHA对智力发育、心血管疾病等有良好效果，因此将DHA作为医药品开发，目的主要是改善脑机能防治老年性痴呆症;改善皮肤炎症;抗脂肪血症状。

2）食品工业

由于婴儿和老人及少数特殊病人需强化DHA和EPA的摄入，目前国际上开发出了DHA和EPA婴儿奶粉、DHA饮料，富含DHA和EPA的鸡蛋、罐头、鱼肉香肠、火腿、炼乳、豆腐乳、蛋黄酱、糖果、食用果胶、冷冻沙丁鱼等食品。

3)饲料工业

特种海产如对虾等，DHA是必需的营养成分，养殖富含DHA的海藻并做成饵料，将大有前途。

1.4 DHA来源

目前，DHA的来源主要有两种：鱼油加工产品与发酵法生产的微生物油脂^[7]。长期以来，DHA主要来源于深海鱼油，但存在诸多缺点：

1）鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同；

2）鱼油中含有多种脂肪酸成分，其中包括EPA（二十碳五烯酸），并可能含有因环境污染所致的重金属等，无法使DHA得到充分分离和纯化；

3）鱼油易于氧化，粗制鱼油DHA产品还有难以消除的鱼腥味和其它不良风味；

20世纪提出的”单细胞油脂”、”微藻油”是以微生物作为来源发酵得到的含多不饱和脂肪酸的油脂，已成为当前人们关注的热点。通过微生物发酵法制备DHA，与传统鱼油来源相比，具有以下优点：

1）微生物生长快，易于大规模培养；

2）多不饱和脂肪酸含量高；

3）不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；

4）氧化稳定性较好。

因此微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。

2.裂殖壶菌介绍

Schizochytrium又称裂壶藻，属于真菌门(Eumycota )、卵菌纲（Oomycetes )、水霉目(Saprolegniales )、破囊壶菌科（Thraustochytriaceae )的一类类藻的海洋真菌，单细胞、球形，如图2。Schizochytrium细胞积累大量对人体有用的活性物质，如：油脂、色素（类胡萝卜素、叶黄素、虾青素等）、角鲨烯^[8]等，其中油脂占细胞干重的70%以上，总脂肪酸中DHA的质量分数高达35%-45%，且细胞中90%以上的油脂以人体易吸收的中性油脂#8212;#8212;甘油三酯（TG)形式存在，还有的是以卵磷脂（PC)形式存在，如1-棕榈-2-DHA-PC和1，2-双-DHA-PC^[9]。

对于Schizochytrium的安全性评价，Hammond等人进行了全面、详细的研究，包括对大鼠的亚急性毒性实验^[10]、对大鼠和兔子发育的毒性实验^[11]、对大鼠生殖影响的实验^[12]、对大鼠的诱变实验^[13]以及对猪发育的安全性评价^[14]，均未发现有任何毒副作用。且其安全性己得到美国食品药品管理局局（Food and Drug Administration )的认可，能开发医药、食品（尤其是孕妇、哺乳期妇女和儿童食品）以及饲料等系列产品。美国己经批准Schizochytrium为GRAS( Generally Recognised as safe)级营养添加物。

图2 裂殖壶菌的细胞形态

3.裂殖壶藻合成DHA的代谢机理

裂殖壶菌不是通过传统的FAS 途径合成DHA。Metz等^[15]对Shewanella SCRC2738 和Schizochytrium sp.的基因组成进行研究，结果表明，Shewanella SCRC2738的一段基因上存在5个开放阅读框，框中至少11个区域是编码酶的功能域，其中有8个功能域与PKS合成酶(Polyketide synthase)密切相关，Schizochytrium sp.的基因片段中也存在同样的结构域，由此提出Schizochytrium合成DHA的途径类似于细菌中的PKS途径，称为PUFA合成酶途径。

该途径中也存在一个类似于脂肪酸合酶的多酶复合体#8212;#8212;PKS合成酶，主要存在于海洋细菌和一些能合成多不饱和脂肪酸的真菌中^[16]，它包括β-酮酰合成酶、β-酮酰-ACP还原酶、烯酰还原酶、脱水酶/异构酶、酰基转移酶和酰基载体蛋白。在该多酶复合体作用下，乙酰-辅酶A和丙二酸-单酰辅酶A作为基本单位，通过缩合、还原、脱水、还原/异构的循环，合成DHA(图3)。与FAS途径一样，该途径也是以酰基载体蛋白(ACP)作为延长碳链的共价结合位点。但由于PKS合成酶与FAS合成酶在酶的组成上略有不同，PKS合成酶中存在一个脱水酶/异构酶，因此PKS 途径不存在需氧去饱和引入双键的过程，而是在碳链延长过程中直接形成双键。

图3 DHA合成的多不饱和脂肪酸合成酶途径^[17]

4.本课题研究目的及意义

当前，以DHA为代表的不饱和脂肪酸主要应用于婴幼儿食品和医药保健品领域，随着人们保健意识的加强，不饱和脂肪酸的市场潜力非常巨大。传统DHA来源深海鱼油，但鱼的种类、季节、地理位置等因素的差异造成了油含量和油中不饱和脂肪酸含量的不稳定，且鱼油提取获得的DHA中胆固醇含量高，且含有大量的EPA（Eicosapetaenoic acid, C22:5）及多种矿物质，限制了DHA的应用范畴。受到以上因素的限制，深海鱼油难以满足日益增长的市场需求，因此，微生物油脂将是未来不饱和脂肪酸的主要来源。

氧作为环境因素及营养物质参与到裂殖壶菌细胞生长和油脂积累中，供氧高时，细胞代谢加快，细胞繁殖增强，使得生物量积累增加。但是裂殖壶菌合成DHA是通过聚酮合酶途径(PKS)，PKS途径属于厌氧途径，只有在低氧环境下，DHA含量才会高，而高生物量是高含量油脂的前提，因此在工业生产中，通常选择前段高供氧，后段低供氧来解决这个矛盾。但是由于裂殖壶菌生长温度较高，供氧也较高，可能使得发酵中后期生产的多不饱和脂肪酸被氧化掉。因此为了提高多不饱和脂肪酸，我们选择添加VC来解决，文献报道VC可以提高细胞的抗氧化能力，降低ROS对细胞的氧损伤，并且可以提高葡萄糖6磷酸脱氢酶活性，使得细胞能够产生更多的NADH，促进胞内的氧化还原反应，从而改善细胞生长和油脂积累。

抗坏血酸钠是水溶性抗氧化剂。它的抗氧化反应机理是:分子结构中具有易于脱氢的基团,在水溶液中容易与游离氧发生反应,从而除去氧,达到抗氧化的效果，是一种氧清除型抗氧剂。

本实验通过添加不同浓度抗坏血酸钠，考察其发酵差异，以及抗坏血酸钠对发酵过程中总抗氧化能力(T-AOC)和氧自由基（ROS）的影响，选择最适抗氧化剂浓度，探讨在此种添加下不同转速对DHA产量的影响，为最终实现DHA工业化发酵过程中高生产强度的需求奠定基础。

参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

研究的问题：

目前，利用海洋微生物发酵制备dha已成为研究的一大热点，裂殖壶菌广泛应用于dha的工业化生产，由于dha是一种多不饱和脂肪酸，因此存在易氧化等缺点。本研究针对此项问题展开研究，考察抗坏血酸钠对裂殖壶菌发酵产dha的影响，为后续发酵水平的提高奠定基础。