1.1 抗冻酵母

本实验室通过低温等离子体技术诱变，选育得到一株抗冻能力强的酿酒酵母菌种AFY-1^[1]。用生理盐水制备的细胞悬液在-20 ℃条件下冷冻并冻藏35 d后，抗冻酵母AFY-1的细胞存活率为87.3%，远远高于其原始酵母的46.4%。此外，抗冻酵母AFY-1及原始酵母在新鲜面团中的发酵力同样为714 ml，而当面团在-20 ℃条件下冷冻并冻藏35 d后，抗冻酵母AFY-1的发酵力仍然维持在605 ml，远远高于原始酵母的150 mL。定量分析结果表明，酵母的抗冻能力与胞内海藻糖、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、甘油等成分的含量显著相关^[1-2]。

1.2 细胞固定化技术

细胞固定化技术是二十世纪六十年代发展起来的一种新型生物技术，所谓细胞固定化技术是指利用物理或化学手段将游离的微生物细胞定位于限定的空间区域，并使其保持活性和可反复使用的一种新型生物技术^[3-5]。固定化细胞保持了细胞的生命活动能力，它不但比游离细胞的发酵更具有优越性，而且比固定化酶有更多的优点^[6]。

和游离细胞相比，固定化细胞提供了很多优势：高细胞密度或高细胞负载量，提高了单位体积的产量，缩短了反应时间，减小了反应器的型号，从而降低了成本费用，由于固定化细胞的稳定再生从而可以长时间的重复利用，形成连续过程后可提高洗脱率，进而降低损失，提高底物利用率，降低污染微生物的几率，简化过程设计，获得均一的产品以及提高细胞对终产物的忍耐力和保护细胞免受外界不利环境的影响^[7]。

1.3 固定化酵母对糖、乙醇、酸、温度的耐性

在乙醇发酵生产过程中，发酵代谢产物及环境会抑制酵母生长及发酵能力，从而大大降低了发酵效率^[1-2]。酵母细胞能够快速适应这些危害作用以保持继续生长，是提高乙醇产量的关键所在。研究固定化酵母对发酵代谢产物及环境因素的耐受性，对于提高乙醇产率、降低生产乙醇的成本具有重要的指导意义。

1.3.1 对糖的耐受性

王杏文^[8]等以海藻酸钙来包埋树干毕赤酵母并与游离酵母相比较，实验发现固定化酵母还原糖利用快于游离酵母并且固定化酵母耐高糖渗透压的能力强于游离酵母，在

初始糖浓为180 g/L情况下，经36 h发酵，其最终乙醇浓度明显高于游离酵母发酵。李文等^[9]的研究表明与游离酵母细胞发酵的微环境相比，固定化粒子与包裹在表面的发酵液形成的微环境中，细胞密度较高，固定化粒子内部消耗葡萄糖较快，发酵液中基质浓度与固定化粒子内部基质浓度差增大，有利于葡萄糖的传质^[10]，并且载体可保护酵母细胞免受水力剪切的影响^[11]。

1.3.2 对乙醇的耐受性

众多的研究发现，固定化酵母可以提高酵母细胞对乙醇等发酵抑制物的耐受性。

Norton等^[12]解释这一现象是由于固定化载体在细胞表面形成了保护层，或者是由于

载体对氧传质的限制改变了细胞膜上饱和脂肪酸的浓度，同时也发现，固定化细胞对基

质渗透压的耐受性也增强了。Norton等^[12]还发现，固定化酵母细胞内能够产生调节

压力的化合物（如多元醇类），是由于固定化技术诱发的渗透压而产生的，此类化合物

能够降低水的活度，进而对发酵抑制物有强耐受性。王杏文等^[8]也研究了固定化酵母

和游离酵母对发酵副产物及产物乙醇的耐受性，结果表明，与游离酵母相比，固定化酵

母对发酵抑制物具有更强的耐受能力；并且，固定化酵母对高糖渗透压、温度变化等不

利发酵环境的耐受能力同样强于游离酵母。

1.3.3 对酸的耐受性

王杏文等^[8]以游离和固定化树干毕赤酵母为发酵菌株，60.0 g/L混合糖(葡萄糖与

木糖比率为2:l)为发酵底物，前后进行了29轮间歇发酵，其间共进行4次不同低pH值(2-3.6)处理，结果表明，低pH处理对酵母具有一定损害，但经过多轮处理驯化和恢复性发酵，酵母完全可以适应低pH环境，经过4轮处理后，其糖利用率几乎不再下降，而固定化酵母对低pH值适应能力明显强于游离酵母，pH值为3.6的环境并不能引起其发酵性能下降，经过3次处理后对pH值为2.4~3，2的环境就已完全适应。实验室条件下pH值为2.4~2.8的处理条件是适宜的。

1.3.4 对温度的耐受性

李丹^[13]的研究表明随着吸附温度的升高，酵母细胞吸附量呈先上升后下降的趋势，当温度在25 ℃时，载体吸附酵母数达到最大为5.76#215;10⁷ 个/g。这可能是由于随着温度升高，酵母细胞活力较强，细胞新陈代谢旺盛，向载体表面和内部扩散速率加快，因而吸附量升高。然而当温度达到35 ℃时，载体对酵母细胞的静电引力下降，解析作用加速，载体对酵母细胞吸附不牢，容易脱落^[14]。但温度在15 ℃和25 ℃之间时，吸附量变化不大，说明无论是温度低造成的细胞扩散速率减慢还是温度高造成细胞吸附力下降，都需要在温度过低或过高时表现才较为明显。综合发酵速率和乙醇最终浓度，发酵温度在28 ℃时，最有利于乙醇发酵。

李涛等^[15]报道在啤酒发酵中用发酵温度从12 ℃到15 ℃糖降速度显著增快，乙醇

产量和发酵度也明显增高，因而采用较高温度进行发酵可明显缩短发酵时间，但是发酵温度增高，酵母活性也随之增加，代谢旺盛，与酵母增殖相关的代谢副产物#8212;#8212;双乙酰也高于其他温度。

从上述可以看出：在乙醇发酵生产过程中，固定化酵母对发酵代谢产物及环境会抑制的耐受性要优于游离酵母。将细胞固定化技术应用于抗冻酵母，可以改善发酵过程中发酵代谢产物及环境对酵母的毒害作用，使得抗冻酵母在酿酒领域中会有更好的应用。

1.4 现有研究中存在的问题

在乙醇发酵生产过程中，酵母细胞会遭受发酵代谢产物及环境抑制因子的危害作用，这些危害作用会抑制酵母细胞生长及发酵能力，从而导致迟缓的发酵速率，因此，提高酵母的多种耐性，尤其是乙醇耐性、高渗耐性和温度耐性，已经引起广泛关注。

1.5 研究的目的及意义

固定化酵母相对于游离酵母，具有独特的优势。通过比较原始酵母和抗冻酵母AFY-1的游离细胞及固定化细胞对糖、乙醇、酸、温度的耐受性，找出固定化抗冻酵母AFY-1的优势。研究固定化抗冻酵母AFY-1对糖、乙醇、酸、温度的耐性，探究固定化抗冻酵母AFY-1乙醇发酵的最适条件，将为固定化抗冻酵母AFY-1在乙醇发酵中的应用打下基础。

参考文献 ：

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[2] Shi X, Miao Y, Chen J Y, et al. The relationship of freeze tolerance with intracellular compounds in baker's yeasts[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 172(6): 3042-3053.

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[4] 奚悦, 焦姮, 刘小宇. 固定化细胞技术及其应用研究进展[J]. 生命的化学,2013,(5).

[5] 于梅艳, 姜巧娟. 细胞固定化技术及其应用的研究进展[J]. 生物技术世界, 2012, (2):7-9.

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母发酵的影响[J]. 江西农业大学学报, 2007, 29(5): 833-836

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[13] 李丹. 酒精高糖发酵及酵母固定化研究[D]. 华南理工大学, 2011.

[14] 耿曙光, 荆忠胜, 张兴华. 影响酒精酵母产生乙醇耐性的因素[J].中国酿造,2004,138(9):8一10.

[15] 李涛. 固定化酵母在啤酒发酵中应用的研究[D]. 江南大学, 2010.

2.1 研究内容

（1）进行乙醇发酵实验，比较游离和固定化原始酵母、以及游离和固定化抗冻酵母对糖、乙醇、酸、温度的耐受性。

（2）进行固定化抗冻酵母的重复乙醇发酵实验，探讨乙醇收率、发酵速度、细胞数的变化及相互关系。

2.2 实验材料与方法

2.2.1 酵母

抗冻酵母AFY-1菌种（本实验室选育菌种）。

2.2.2 试剂与仪器

1）实验试剂

海藻酸钠（相对分子质量：80000-12000；M/G摩尔比：1.56；质量浓度10 g/L、20 ℃条件下的粘度：gt;2000 cps)，sigma公司；无水氯化钙（纯度gt;99%），汕头市西陇化工厂有限公司）。

2）实验仪器

SW-CJ-ZD型双人洁净工作台；JY6002电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHP-150型恒温箱，上海精宏实验设备有限公司；SHB-IIIA型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；BCD-208k/A CJN 型冷藏冷冻箱，青岛海尔股份有限公司公司。

2.2.3 实验方法

1）酵母制备

抗冻酵母菌种AFY-1保存于4 ℃、YPD斜面培养基。使用时，用接种环将抗冻酵母菌种AFY-1接种至装有100 mL种子培养基（葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%）的250 mL三角瓶中，在180 rpm、30 ℃条件下震荡培养21 h至对数期后期，作为种子液。

取5 mL种子液，接种至装有100 mL扩大培养基（葡萄糖220 g/L，酵母浸粉30 g/L，无机离子母液20 mL/L，维生素母液20 mL/L）的250 mL三角瓶中，在180 rpm、30 ℃条件下震荡培养24 h。培养结束后，3000 rpm离心10min，收集菌体，用去离子水洗涤2次，抽滤，得到鲜酵母泥。

2）酵母固定化

称取2 g的鲜酵母泥，用适量的去离子水制得酵母悬液。另称取1.45 g的海藻酸钠，加入适量去离子水，加热溶解，冷却至室温，制得海藻酸钠溶液。将酵母悬液和海藻酸钠溶液混合，用去离子水定容至100 mL，制得海藻酸钠-酵母混合液。在蠕动泵的驱动下，将海藻酸钠-酵母混合液通过硅胶软管和注射针滴入轻微搅拌的100 mL 17.45%氯化钙溶液中，固化1.16 h。固化结束后，收集凝胶颗粒状的固定化酵母，用去离子水洗涤3次，存放于4 ℃冰箱中备用。测定固定化酵母的活细胞数、总细胞数、活细胞率。

3）乙醇发酵

1）糖、乙醇、酸、温度对固定化抗冻酵母的乙醇发酵性能的影响

分别设定不同糖、乙醇、酸浓度的基础培养基（葡萄糖350 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉61 g/L）进行乙醇发酵。

（1）不同糖浓度对固定化抗冻酵母AFY-1发酵性能的影响

将基础培养基的葡萄糖浓度分别设定为： 350、400、450、500、550 g/L，测定固定化酵母细胞的乙醇发酵性能。

（2）不同乙醇浓度对固定化抗冻酵母AFY-1发酵性能的影响。

将基础培养基的乙醇浓度分别设定为：0%、5%、10%、15%、20%（v/v），测定固定化酵母细胞的乙醇发酵性能。

（3）不同丁酸浓度的培养基

将基础培养基的丁酸浓度分别设定为：0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%（v/v），测定固定化酵母细胞的乙醇发酵性能。

（4）不同温度

分别设定在10、20、30、40、50 ℃，测定固定化酵母细胞乙醇发酵性能。

2）固定化抗冻酵母的重复使用发酵性能

用基础培养基和高糖高酸培养基进行乙醇发酵，将50 mL发酵培养基装入150 mL锥形瓶中（共75瓶），加入固定化酵母，使发酵培养基中细胞数为5.0#215;10⁸ 个/50 mL，在30 ℃、180 rpm、无氧条件下振荡培养。在培养过程中，分别在0、8、16、24、32、42 h时取3瓶样（3次重复），测定乙醇浓度、残糖浓度和活细胞数、总细胞数、活细胞率。

每批发酵结束后，将固定化酵母回收，用无菌生理盐水洗3次，进行下一批发酵，重复上述操作。测定每批发酵过程中的固定化酵母活细胞数、总细胞数、活细胞率。

2.3 测定

2.3.1 发酵液中的乙醇和残糖浓度

发酵后，发酵液中的乙醇浓度和残糖浓度采用生物传感器（SBA-40E，山东省科学院生物研究所）进行测定。

2.3.2 游离酵母的活细胞数、总细胞数、活细胞率测定

对象样品：发酵前和发酵后的活细胞率

取酵母悬液稀释到适当倍数后，取0.1 mL悬液和0.9 mL美蓝液于试管中，染色10 min。镜检计数，计算出游离酵母细胞的活细胞率。

2.3.3 固定化酵母的活细胞数、总细胞数、活细胞率测定

对象样品：发酵前和发酵后的活细胞率

1)溶解、定容

取3 g的固定化细胞，加适量0.1 M柠檬酸0.2 M磷酸氢二钠溶液溶解3 h，定容至25 mL。

2）计数

取上述悬液稀释到适当倍数后，取0.1 mL悬液和0.9 mL美蓝液于试管中，染色10 min，镜检计数，计算出固定化酵母的活细胞率。

3）固定化细胞载量

细胞载量(个/g)=X#215;400#215;10⁴#215;n#215;10/80/3 （1）

式中，X为5格中的细胞总数，n为稀释倍数。