1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

红景天(又名北极根，黄金根)是景天科植物之一，该科植物原产于东西伯利亚的北极圈内。红景天广泛分布于欧洲和亚洲的极圈和多山地区中。其多生长于海拔11000至18000英尺以上。红景天属植物在全球约有近100种，我国有70馀种，青藏高原有55种，西藏有32种，分布于我国东北、华北、西北及西南的高寒山区[1]。红景天苷是红景天根的提取物，红景天苷（salidroside）是传统中药红景天中最重要的有效成份之一，临床上具有抗疲劳，抗氧化，保肝，改善血液循环等多种药理功能[2-4]。目前从其根、茎中分离鉴定的化学物质包括：挥发油，脂肪，甾醇，有机酸，酚类以及苷类等。其中苷类化合物是其药理活性研究中报道最多的一类成分[6]。红景天属植物化学成分种间差异很大，但绝大部分都含有苯烷基苷类，包括苯乙基苷类（红景天苷，其苷元为酪醇）、苯丙素苷类（络萨维，洛塞琳）和酚苷。此外，红景天还含有芦丁苷、熊果苷、异槲皮苷等苷类成分[7-9]。由于其功能多样且不易从自然界获得，故人工合成具有很大的市场价值。本实验主要是通过构建糖基转移酶zs1和蔗糖合成酶ss的双酶共表达重组工程菌，利用该工程菌催化酪醇糖基化合成红景天苷。糖基转移酶将生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶(glu-酶)，葡萄糖苷转移酶是转移时连葡萄糖的糖苷键一起转移着的酶[10]。蔗糖合成酶（ss）是植物体内催化蔗糖合成的酶之一，催化游离果糖与葡萄糖工体udpg反应生成蔗糖的可逆 udp反应：glu 果糖---蔗糖 udp[11]。在传统的酶耦联法再生体系中, 需要将体系内所用到的酶分别进行表达纯化等步骤, 操作麻烦, 成本高, 且不同批次的菌种培养条件差异会造成最适酶比不稳定且难以调控, 有可能造成双酶体系效率不高。利用共表达策略构建人工酶有可能使两个酶的表达量固定在适当的比例,且易于分离纯化， 从而提高生产和催化效率[12]。 近年来，人们在双酶共表达这个领域取得了很多成果，主要在双酶共表达的质粒载体优化、表达过程中的启动子调控以及合适的共表达载体宿主菌选择等。例如，吴希等在甲酸脱氢酶与手性醇脱氢酶的融合体系构建的研究中，详细的讲述了一个双酶表达载体应该如何构建及这种体系构建与传统方法相比所具有的优势[13]。alexander gutmann等人在ogt-susy的双酶融合表达中已经知道的o-糖基转移酶（ogts）通过糖基合成（蔗糖从大豆合成）实现udp依赖性的蔗糖的转换，蔗糖合成反应不仅能再生udp-葡萄糖用来给ogt（高达9倍）提供底物供体，而且还能克服在二氢査耳酮的β-d-糖基化形成（增加了底物的转化和产物产率的增长）过程中的热力学限制。使用所有耦合酶的最佳反应条件，极大的提高了简单酶耦合时所产生的收益率[14]；等等。在这个课题中，我们的主要任务把合成上述两个酶的基因通过基因工程的方法构建到同一个质粒载体上，并由启动子强弱调控酶的表达量，经转录翻译后以合适的比例表达两种酶蛋白。首先，我们要分别提取两种酶的的目的基因，选择合适的酶切位点将两个酶的基因通过dna连接酶连接到同一个质粒载体上，并对启动子进行优化。通过核酸凝胶电泳判断目的基因是否连接到质粒载体上了。将验证正确的含有目的基因的表达载体通过转化反应导入到大肠杆菌宿主中进行表达。为了验证转化的成功与否，确保宿主菌的成功构建，我们还要通过对转化涂布的平板设置阴性阳性对照，结合菌落pcr验证还有公司测序验证，最终筛选出可以共表达蔗糖合成酶和糖基转移酶的受体细胞来培养。紧接着，我们要做的就是粗酶的提取和酶活的测定了，收集菌体，重悬及离心等重复两次, 最后利用合适体积的缓冲溶液重悬菌体沉淀。超声破碎重悬后菌液, 获得粗酶液。4℃离心30 min 获取蛋白上清液进行酶活的测定, 取上清或沉淀以及粗酶液进行 sds-page 电泳。我们不仅仅要利用共表达体系合成出这两种酶，而且要求它比两酶在分别表达后再进行一锅反应的条件具有更好的收率，否则导致试验不具有市场可行性。本课题研究目的及意义，糖基转移酶广泛存在于生物中，是生物体内实现糖基化的主要酶类。本实验室构建的含糖基转移酶zs1的大肠杆菌工程菌，能够催化酪醇糖基化合成红景天苷。该反应的关键性限制因素在于底物udpg十分昂贵，而利用蔗糖合成酶ss构建辅酶循环体系，可以实现udpg的循环再生。计划通过双酶共表达工程菌的构建，实现zs1和ss双酶共表达，并对其酶学性质进行研究[15]。

参考文献

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案