1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1 概述

1.1 前言

3-羟甲基-1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉（7）(图1-1)是合成HO-3867的关键中间体。HO-3687，化学名为3,5-双(4-氟苯亚甲基)-1-[(1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉-3-基)甲基]哌啶-4-酮[1-5]，是一种含有酰硝氮氧自由基的姜黄素类似物，也是一种安全的STAT3抑制剂，可以选择性地杀死卵巢癌细胞。

图1-1 3-羟甲基-1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉的结构式

1.2 卵巢癌

1.2.1 卵巢癌的现状

卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一， 在我国卵巢癌发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，但病死率居女性生殖系统肿瘤首位。严重威胁着妇女的健康，应成为女性重点预防的妇科恶性肿瘤。卵巢癌早期无明显自觉症状，早期患者5年生存率为70%～90%，而晚期卵巢癌患者的5年生存率仅为20%，这是因为约70%的卵巢癌患者发现时已为晚期，早期诊断技术以及长期有效的治疗方案的缺乏也是卵巢癌病死率居高不下的原因[6-7]。

1.2.2 卵巢癌的治疗发展

目前，治疗IC-IV期卵巢癌的规范化方案是在理想肿瘤细胞减灭术的基础上辅助化疗。虽然近年来卵巢癌的治疗有了长足发展，在满意的肿瘤细胞减灭术基础上辅以铂类和紫杉醇为主的联合化疗的治疗策略改善了初步治疗卵巢癌的预后，但其总体生存率仍无明显改善，晚期卵巢癌5年生存率仍徘徊在30%左右。究其根源，肿瘤原发或化疗后的获得性耐药是治疗失败的主要原因之一[8]。

化疗耐药包括原发耐药和获得性耐药，原发耐药是指患者在初治时就对化疗药物不敏感，其体内存在固有的耐药肿瘤细胞，在化疗过程中仍不断增殖。获得性耐药多由于个体肿瘤细胞在病变的发展和治疗过程中发生改变，形成新的亚型，最终出现对化疗药物不敏感的临床复发灶[6-7]。

由于绝大多数患者在化疗过程中产生耐药，从而大大降低了治疗效果。卵巢上皮癌多药耐药机制十分复杂，目前研究认为可能涉及肿瘤细胞内化疗药物的外排、DNA损伤与修复、细胞凋亡异常和信号传导通路障碍等分子机制，但是至今仍未找到安全有效的逆转耐药靶点。因此，寻找新的肿瘤标记物和治疗靶标一直以来都是卵巢癌研究领域的热点[9-10]。

1.3 STAT3

1.3.1 STAT3的性质

信号传导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)为细胞内重要的信号转导蛋白，是一类由750~800个氨基酸组成的DNA结合蛋白，在多种肿瘤组织或细胞中高度表达，在慢性炎症介导肿瘤形成的过程中发挥重作用，在正常细胞内调控生长、增殖、分化，与肿瘤的发生发展密切相关[11-12]。

1.3.2 STAT3的活化

STAT3的活化依赖于酪氨酸705位的磷酸化，磷酸化的STAT3会通过磷酸化的酪氨酸与另一个STAT3的SH2结构域相互作用形成二聚体，二聚体的STAT3进而转入核内，通过结合特异性的DNA序列，启动下游基因的表达。持续的STAT3活化与肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、侵袭、转移、血管形成及免疫逃逸密切相关，活化后的STAT3发挥着重要的致癌作用，以及对一些抗癌药物产生抗性[13]。

1.3.3 STAT3抑制剂及其分类

由于持续活化的STAT3在肿瘤形成中具有重要作用，因此，抑制STAT3的过度表达是治疗肿瘤的手段之一。于是靶向抑制STAT3信号途径的寡核苷酸、小分子抑制剂、肽适配子在抗肿瘤治疗中的应用被广泛地开展。实验表明，它们具有抑制肿瘤的效果。体内外阻断或抑制肿瘤细胞中STAT3的信号通路可抑制细胞恶性增殖和存活,并诱导细胞凋亡，而对正常细胞却无影响。因此，STAT3已成为肿瘤诊断和治疗的重要靶点[14]

目前已发现的针对STAT3的抑制剂主要有核酸类抑制剂、蛋白类抑制剂以及小分子化合物抑制剂等。其中靶向STAT3核酸类抑制剂根据其作用方式可分为小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,AS -ON)、诱饵寡核苷酸(decoy oligonucleotide,Decoy ON)、G-四联体寡聚脱氧核苷酸(G-quartet oligodeoxynucleotides，GQ-ODN)和显性负性质粒(dominant-negative plasmids)等5种，其中小分子抑制剂是STAT3抑制剂数量最多的一类。这些核酸类抑制剂能够在DNA或RNA水平上，通过多种方式影响STAT3活性，抑制其下游信号分子的表达，发挥抗肿瘤的活性。此类抑制剂具有作用位点明确、特异性强以及可操作性强等优点，已成为分子靶向治疗肿瘤研究中不可或缺的工具,具有潜在的临床应用价值[15]。

1.3.4 STAT3抑制剂化合物

（1） S3I-201

性质：S3I-201选择性抑制Stat3 DNA结合活性。S3I-201抑制Stat3#183;Stat3复合形式,不依赖于Stat3的激活状态。S3I-201不干涉Lck SH2与同源pTyr肽结合。

体外研究： S3I-201作用于NIH 3T3/v-Src鼠成纤维细胞和人类乳腺癌MDA-MB-231, MDA-MB-435, 和MDA-MB-468 细胞，可以抑制Stat3激活。S3I-201 抑制Stat3依赖的转录活性。 S3I-201 也抑制编码cyclin D1, Bcl-xL,和surviving 的Stat3-调节基因的表达[16]。S3I-201可以降低 pS727STAT3水平和降低TGF-β通路蛋白水平。S3I-201也可抑制CD133 和CD133#8722; Huh-7细胞[17]。最新研究显示S3I-201作用于Hep-G2, Huh-7和SK-HEP-1细胞，加强 Cetuximab的抗增殖效果[18]。

（2） Cryptotanshinone 隐丹参酮

性质：Cryptotanshinone是一种STAT3抑制剂，无细胞试验中IC50为4.6 μM，强烈抑制STAT3 Tyr705磷酸化，对STAT3 Ser727作用效果弱，对STAT1和STAT5没有作用效果。

体外研究：Cryptotanshinone是从Salvia miltiorrhiza Bunge(丹参)根中分离的天然化合物, 与丹参酮IIA（没有活性）相比，显著抑制STAT3依赖的荧光素酶活性, 且抑制STAT3 在Tyr705位点磷酸化，和STAT3的二聚体化。Cryptotanshinone (7 μM)处理 DU145细胞，在处理30分钟期间，显著抑制 STAT3 在Tyr705位点磷酸化，而不抑制STAT3在 Ser727位点磷酸化，且Cryptotanshinone(7 μM)处理4小时后，显著抑制JAK2 磷酸化，IC50为~5 μM，但是不影响下游激酶c-Src和 EGFR的磷酸化, 说明抑制STAT3 在Tyr705 位点磷酸化是因为与 STAT3的SH2域结合的直接机制。Cryptotanshinone显著抑制含组成型激活STAT3的DU145 前列腺癌细胞增殖，GI50 为7 μM，通过阻断 STAT3活性, 导致cyclin D1, Bcl-xL, 和 survivin的下调,随后导致在G0-G1期累积。Cryptotanshinone作用于PC3, LNCaP 和MDA-MB-468细胞，微弱抑制生长[19]。

体内研究： Cryptotanshinone 处理ob/ob 小鼠(C57BL/6J-Lepob) 和饮食导致的肥胖 (DIO) 小鼠，显著降低体重和食物摄入，这种作用存在剂量依赖性。Cryptotanshinone处理脂肪组织，显著降低脂肪，显著降低血清甘油三酯和胆固醇水平，且 骨骼肌中, AMPK活性比对照组小鼠高2.5到 3倍。Cryptotanshinone每天按 600 mg/kg剂量处理ob/ob小鼠 (C57BL/6J-Lepob), db/db 小鼠(C57BL/KsJ-Leprdb), 和 ZDF 大鼠, 3天后，显著降低血糖水平，且在整个监测期都维持降低水平[20]。

（3） Stattic

性质：Stattic，第一个非肽类小分子，有效抑制STAT3激活和核易位，无细胞试验中IC50为5.1 μM，高选择性高于STAT1。

体外研究：Stattic抑制gp130受体衍生的含磷酸化酪氨酸的肽结合到STAT3 SH2结构域，这种作用存在强烈的温度依赖性。Stattic对酪氨酸磷酸化的肽结合到酪氨酸激酶Lck的SH2结构域只有很微弱的作用效果。Stattic不抑制其他两个二聚体转录因子(c-Myc/Max 和 Jun/Jun)的二聚化。Stattic抑制荧光素标记的磷酸化肽段结合到STAT1和STAT5b的SH2域。Stattic浓度为10 μM，选择性抑制DNA与STAT3二聚体结合。Stattic抑制STAT3在Tyr705位点磷酸化，而对STAT1在Tyr701(HepG2细胞)位点磷酸化或 JAK1, JAK2, 和c-Src(MDA-MB-231和MDA-MB-235S细胞)磷酸化几乎没有抑制效果。Stattic增加STAT3依赖性的乳腺癌细胞系的凋亡率[21]。

（4） Napabucasin

性质：Napabucasin是一种口服具有活性的Stat3和癌细胞多能性抑制剂。

体外研究：Napabucasin下调Stat3驱动的干细胞基因表达和癌症干细胞性能，并有效抑制高度多功能性癌细胞的自我更新，IC50范围为0.291~1.19 μM，而对正常干细胞没有抑制作用[22]。

体内研究：在负荷PaCa-2异种移植物的小鼠中，Napabucasin (20 mg/kg, i.p.)显著抑制肿瘤生长，复发和转移[22]。

（5） HO-3867

性质：3-羟甲基-1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉（7）合成的HO-3867作为一种姜黄素类似物、选择性的STAT3抑制剂。可以通过STAT3使卵巢癌细胞的BRCA1基因突变失活，提高卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性，诱导癌细胞凋亡[23]。特别是，HO-3867能够选择性抑制STAT3磷酸化，转录和与DNA结合，而不影响其他属性的表达。

体外研究：HO-3867在A2780和其他测试的卵巢癌细胞系中产生显著的细胞毒性， 对非癌卵巢上皮细胞的毒性较低。HO-3867诱导A2780细胞中G(2)-M细胞周期阻滞，并通过caspase-8 和caspase-3的活化促进细胞凋亡。HO-3867阻断人卵巢癌细胞系中JAK/STAT3通路[24]。

体内研究：HO-3867 (100 ppm，口服)抑制小鼠体内卵巢癌异种移植瘤的生长，而没有显著的毒性信号，会抑制pSTAT3，并下调STAT3靶向蛋白。[1] HO-3867通过对STAT3的抑制使顺铂耐药性卵巢癌敏感化[25]。HO-3867 (100 ppm 口服) 通过减少氧化应激并增加PTEN在大鼠肺中的表达，减弱左心室衰竭诱发的肺动脉高血压[26]。

细胞试验: [24]

动物实验: [24]

不同实验动物依据体表面积的等效剂量转换表（数据来源于FDA指南）

动物A (mg/kg) = 动物B (mg/kg) #215; (动物B的Km系数/ 动物A的Km系数)

例如，依据体表面积折算法，将白藜芦醇用于小鼠的剂量22.4 mg/kg 换算成大鼠的剂量，需要将22.4 mg/kg 乘以小鼠的Km系数（3），再除以大鼠的Km系数（6），得到白藜芦醇用于大鼠的等效剂量为11.2 mg/kg。

大鼠剂量 (mg/kg) = 小鼠剂量 (22.4 mg/kg) #215; [小鼠的Km系数(3)/大鼠的Km系数(6)]= 11.2 mg/kg

1.3.5 STAT3与卵巢癌的研究现状

已有文献[27]探索靶向封闭STAT3信号传导通路对卵巢癌耐药的逆转作用。

【方法】转染针对STAT3的特异性siRNA，靶向封闭卵巢癌细胞内STAT3的表达及其信号通路的传导，用Real time PCR及免疫蛋白印迹（Western blotting）检测转染细胞内STAT3，及其活化形式pSTAT3的mRNA及蛋白表达水平，流式细胞术（FCS）检测不同处理组细胞的凋亡率，MTT法检测不同处理组细胞的存活率。

【结果】与各对照组细胞相比，si-STAT3转染组卵巢癌细胞内STAT3及pSTAT3的表达均显著下降。STAT3被靶向封闭后，耐药的卵巢癌细胞对DDP的IC50值明显下降，凋亡率显著增加，差异均有统计学意义。

【结论】靶向阻断STAT3信号传导通路的作用可以增强卵巢癌对DDP的敏感性。

2 3-羟甲基-1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉(7)的合成

7

图2-1 3-羟甲基-1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉(7)的合成路线

参考文献

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详见附件

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1 待研究或者解决的问题：

一般3-羟甲基-1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉（7）的合成方法是以2,2,6,6--四甲基--哌啶酮为原料，经溴代，facorskii, 钨酸钠氧化，四氢铝锂还原等4步反应合成。过程较冗长，还原反应过程剧烈，产率偏低，后处理过程繁琐，不利于工业化生产。