一、蛋白酶PT121简介

（1）蛋白酶PT121的概况

蛋白酶是一类重要酶类，可以用于洗涤及工业催化等诸多领域。金属蛋白酶PT121作为重要的工业酶可以催化多种小肽合成，然而作为重要的工业化蛋白酶表达量至今仍然较低，生产成本昂贵。本课题拟通过表达体系优化提高蛋白酶PT121的表达量。并对重组蛋白酶进行定向进化提高其催化阿斯巴甜的合成能力。来源于金属蛋白酶M4家族的蛋白酶PT121 (Pseudolysin) 具有较高的稳定性，其中Thermolysin表现出较高的温度耐受性，而Pseudolysin由本实验室筛选到的来源于铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa PT121所产蛋白酶^[1]，酶学性质上除了温度稳定性的优势外还具有较高的溶剂稳定性。

（2）典型的耐有机溶剂模型蛋白

天然耐有机溶剂蛋白酶PT121是从铜绿假单胞杆菌(P.aeruginosa)所分泌物提取的弹性蛋白酶。在50℃或其以下保温1 h后，蛋白酶PT121活性保持在90%以上；于60℃保温1h后，酶活残留大于75%，而70℃保温1h后几乎失去酶活性；蛋白酶PT121在pH6.0-11.0范围保温1h酶活无明显损失，在pH5.0时蛋白酶活力仍能维持原始活力的70%以上；蛋白酶PT121在多种有机溶剂中显示了较好的稳定性，尤其在50%DMSO和50%异戊醇体系中的稳定性超过100d，在25%乙腈及50%丙酮体系中的稳定性最低^[2]。以上性质与野生型蛋白酶PT121性质基本一致。

通过双酶法在非水体系中高效催化合成了内吗啡肽-2。其中以耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2催化Boc-Phe-Phe-NH2合成产率高达96%；以耐有机溶剂蛋白酶PT121催化合成Boc-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2产率高达84%^[3]。蛋白酶PT121是一个典型的耐有机溶剂模型蛋白，尽管目前已有报道该酶基因lasB在毕赤酵母及大肠杆菌中异源表达但酶活仍然较低^[4]。

二、蛋白酶表达研究概述

大量的碱性蛋白酶已经实现了工业化生产。很多的嗜热菌蛋白酶类中的金属蛋白酶，例如类嗜热菌蛋白酶和铜绿假单胞菌素的表达仍然是受限的。有如下方法能提高金属蛋白酶PT121表达。

（1）在分泌型工程菌上表达

目前嗜热菌类蛋白酶的在枯草芽孢杆菌及毕赤酵母宿主细胞外表达能达到10-50mg/mL，可以通过增加枯草芽孢杆菌及毕赤酵母宿主细胞的基因剂量或优化这两种宿主细胞的培养条件促进蛋白酶PT121胞外表达，但增加基因剂量提高产量并不是一个很好的途径,而进行密码子的优化可以有效提高产量。