1.1甲醇的利用现状和优势

当前生物制造的原料仍然以粮食为主，但随着粮食危机日益加剧以及其价格不断攀升，以粮食为原料的生物制造正面临严峻考验。为了解决原料来源问题，实现生物制造可持续发展，目前逐渐将”甲醇经济”发展为合理的可替代能源，以甲醇为原料，从而缓解化石能源的紧缺。与其他原料相比，甲醇具备以下优势：①价格低廉，当前甲醇的价格是葡萄糖价格的1/3；②来源广泛，从天然气、煤化工、生物质等均可合成；③含能高，为目标产物的合成提供充足还原力。因此，以甲醇替代粮食作为原料，可以大幅度降低生物制造的成本，以及提供更充足的还原力，实现生物制造的的可持续发展。

1.2甲醇利用微生物的研究现状

据研究报道所知，自然界中存在能够天然代谢甲醇的微生物，如真核类毕赤酵母、汉逊酵母以及假丝酵母等，原核类甲醇芽孢杆菌、甲基单孢菌以及甲基杆菌等。但是，天然甲醇营养菌仍然难以被改造为高效的细胞工厂，一方面，大多数甲醇营养菌为严格好氧型，另一方面，菌株遗传操作工具低效，限制了菌株代谢工程方面的改造。因而，随着合成生物学的逐渐发展，构建甲醇代谢途径被认为是实现甲醇高效生物转化的有效途径。在甲醇营养型菌株中，甲醇经甲醇脱氢酶转化成甲醛，后经过磷酸核酮糖途径（简称RuMP途径）或者丝氨酸循环途径，以及真核生物的二磷酸核酮糖途径（简称RuBP途径）进入中心代谢。其中，甲醇脱氢酶包括依赖PQQ的甲醇脱氢酶，依赖NAD的甲醇脱氢酶（Mdh）以及依赖氧的甲醇脱氢酶。

1.3合成甲醇利用大肠杆菌的路径和现状

目前，国外研究者已开展重组模式菌株代谢甲醇的研究，包括：①Muller等人首次在大肠杆菌中成功组建甲醇代谢途径，且通过¹³C标记实验证实引入的异源基因与内源路径形成了完整的代谢途径；②Witthoff等人将类似的代谢模块引入谷氨酸棒状杆菌中，重组谷氨酸棒状杆菌在葡萄糖和甲醇共碳源的条件下，甲醇消耗速率达到1.7mM/h；③Leβmeier等人构建甲醇代谢模块和赖氨酸脱羧酶的重组谷氨酸棒状杆菌，且¹³C标记检测到标记的戊二胺；④W. Brain Whitaker等人在大肠杆菌中组建甲醇代谢途径并利用其生成天然产物。其中甲醇代谢的研究均无可量化的甲醇消耗，且目前国内在非甲醇营养的模式生物中组装甲醇代谢途径的研究还未报道。

1.4 生物合成赖氨酸中存在的问题

赖氨酸是人体必需氨基酸之一，它对平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善动物营养、促进生长发育均有重要作用。赖氨酸是人类和动物所必需的但自身不能合成的氨基酸之一，。赖氨酸的发酵不同于 L-谷氨酸的发酵，每形成 1 mol 的 L-赖氨酸需要消耗 4 mol 的 NADPH，而每生产1 mol 的 L-谷氨酸只需消耗 1 mol 的 NADPH，因此在L-赖氨酸发酵过程中， 提高代谢途径中的 NADPH 量是增加 L-赖氨酸产量的关键因素之一。 其中，已有研究表明内消旋二氨基庚二酸脱氢酶（ddh）能够加快赖氨酸的合成速率，且赖氨酸合成中必须过表达天冬氨酸激酶（LysC）、二氢吡啶二羧酸合酶（dapA）、二氢吡啶二羧酸还原酶（dapB），然而，天冬氨酸激酶（LysC）和二氢吡啶二羧酸合酶（dapA）对赖氨酸有产物抑制，需通过定点突变解除产物抑制。

1.5本课题的意义

甲醇作为原料用于生物转化的研究刚刚起步，尤其是在非甲醇营养的模式微生物中构建甲醇代谢途径。本实验通过提高大肠杆菌底盘细胞对甲醇代谢中间产物甲醛的耐受浓度与同化能力，实现大肠杆菌利用甲醇为原料的高效转化，为微生物代谢改造提供了新的思路，也为生物制造的原料提供了新的可能。