文 献 综 述

1.研究背景

酵母是最理想的模式生物之一，它是单细胞生物，具有特独的单双倍性生活史，易培养、生活周期短，易于使大量细胞同步接受胁迫因子的作用。而且以酵母为基础的分子生物学研究技术平台日趋完善,很容易制备各种突变体等遗传学研究材料，使研究方便可行，并且其基因表达调控和信号转导机制与动植物中的具有高度同源性^[1]。在酱油等产品的生产过程中，生产菌需要在高盐环境下持续发酵，因此研究酵母的耐高盐能力，从而提高生产菌的耐高盐能力也是很有必要的。另外在研究植物时，在缺乏好的遗传模式植物的情况下，酵母就成为研究植物逆境胁迫的替代模型。

2.高盐胁迫对植物和酵母的危害

盐胁迫包括渗透胁迫和离子胁迫^{[2, 3]}。高盐胁迫对植物的影响一般认为，高浓度的Na 及Cl^-引发盐胁迫，盐胁迫对植物的伤害具有三重效应：降低水势、打破离子均衡最终引起植物毒害。植物水势的改变导致初始生长的下降，因而限制了作物的产量。高盐胁迫对酵母细胞的毒害作用主要包括两方面，一方面是在细胞内积累离子毒害，另一方面是产生渗透压胁迫，使质膜的跨膜渗透压降低而导致细胞失去膨压^[4]。盐胁迫条件下，酵母细胞通过多重复杂的信号传导途径将外界刺激信号传导到细胞核，激活特异性转录因子，从而引起盐胁迫应答反应，这些反应主要包括：质膜吸收的升高、相溶性渗调剂和渗透保护剂甘油的合成和积累以及热冲击蛋白的表达等^[5] 。

3.质膜Na /H 逆转运蛋白基因的研究现状

Na /H 逆向转运蛋白(Na /H antiporter or exchanger)是细菌、酵母、藻类、动物和高等植物的膜系统上普遍存在的一种转运蛋白，参与细胞质内的pH、Na 浓度调节及细胞体积变化等生命活动(Krulwich,1983;Pandan,1987)。目前 Na 吸收过程还不十分清楚，但Na 的外排和区隔化是间接的主动运输过程，主要由Na /H 逆向转运蛋白来完成。它利用质膜H -ATPase或液泡膜H -ATPase及H -PPase泵H 产生的驱动力把Na 排出细胞或将其区隔化入液泡中以消除 Na 的毒害^[6]。

Na /H 逆向转运蛋白最早在大麦质膜上发现（Mitchell,1974）,在甜菜储藏组织的液泡膜囊泡中第一次检测到液泡Na /H 逆转运蛋白的活性(Blumwald,1985)。此后在多种植物如冰叶午时花、拟南芥(Apse, 1999)、碱蓬等中发现Na /H 逆向转运的活性。拟南芥基因测序鉴定出与啤酒酵母中Nhx1非常相似的ATNhx1，这是克隆出的第一批植物逆向转运蛋白基因^[7]。随后，水稻^[8]、碱蓬等高等植物的液泡Na /H 逆向转运蛋白基因相继得到克隆。质膜Na /H 逆转运蛋白与植物的耐盐性密切相关，并从分子水平和生化水平上验证了其具有转运的Na /H 能力。Zhang 等^[9]又将拟南芥液泡膜 Na /H 逆向转运蛋白基因转入番茄和油菜中^[10]，得到了世界上第一批真正意义上的耐盐作物。用200mMNaCl浇灌，转基因植株仍可正常生长、开花并结实。郭兆奎等人^[11]从拟南芥中获得的Nhx1基因构建植物高效表达载体，导入到烟草能从而提高了烟草对高盐环境的耐受性。在提高酵母的耐高盐方面，过去研究主要集中在从上述的植物中获取Nhx1基因，通过构建载体导入酵母内从而提高耐盐能力，目前从酵母中获取该基因的研究还很少。

4.耐高渗酵母研究意义

目前世界上大约有10亿公顷受盐渍化影响的陆地，约占陆地总面积的7%^[12]。我国也有3亿多亩盐渍化土地，约占全国可耕地面积的25%。盐渍化已成为影响社会经济发展重要的环境因素之一^[13]。盐胁迫是全球性的非生物胁迫，许多研究围绕提高粮食作物的耐盐性进行，但植物耐盐性又是非常错综复杂的问题^[14-15]。因此，分析植物对于盐胁迫的反应，研究其反应的生理及分子机制，不仅对揭示植物耐逆的机理有重要的理论意义，而且对于耐盐作物的培育，具有重要的实践意义。在研究植物时，由于缺乏好的遗传模式植物的，酵母基因表达调控和信号转导机制与动植物中的具有高度同源性，于是酵母就成为研究植物逆境胁迫的替代模型。在某些酵母发酵产品的生产过程中，生产菌需要在高盐环境下持续发酵，因此研究酵母的耐高盐基因，从而找到提高生产菌的耐高盐能力的方法也具有很好的实用意义。

【参考文献】

[1]刘向勇. 酿酒酵母Bdf1p转录因子在高盐胁迫反应中调控机制的研究.

[2] Hagemann M., Erdmann N. 1997. Environmental stresses. Cyanobacterial Nitrogen Metabolism and Environmental Biotechnology. In: Rai, A.K. (Ed.), 156-221.

[3] Hayashi H., Murata N. 1998. Genetically engineered enhancement of salt tolerance in higher plants. In: Sato, K, Murata, N. (Ed.), Stress Response of Photosynthetic Organisms: Molecular Mechanisms and Molecular Regulation. Elsevier, Amsterdam, pp. 133-148.

[4]付畅, 杨传平, 刘桂丰等. 酵母耐盐机制的研究进展. 遗传, 2003, 06: 757#8212;761.

[5]于典科. 酿酒酵母转座标签插入突变体菌株263-H9中高盐胁迫应答基因的探寻.

[6]高秀华. 盐芥耐盐相关基因的功能研究.

[7] Prior.C., Potier.S., Souciet J.L., Sychrova H. 1996. Characterization of the NHA1 gene encoding a Na /H antiporter of the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 387, 89-93.

[8]Ohta M., Hayashia Y., Nakashima A., Hamadaa A., Tanaka A., Nakamura T., Hayakawa T. 2002. Introduction of a Na /H antiporter gene from Atriplex gmelini confers salt tolerance to rice. FEBS Letters. 532, 279-282.

[9] Zhang H.X., Blumwald E. 2001. Transgenic salt-tolerance tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit. Nat Biotechnol. 19, 765-768.

[10] Zhang H.X., Hodson J.N., Williams J.P., Blumwald E. 2001. Engineering salt-tolerant Brassica plants: Characterization of yield and seed oil quality in transgenic plants with increased vacuolar sodium accumulation. PNAS. 98, 12832-12836.

[11]郭兆奎, 杨谦等. 酿酒酵母NHX1基因克隆与烟草表达分析.植物分子育种, 2006, 5: 779-785.

[12] Tester M., and Davenport R. 2003. Na tolerance and Na transport in higher plants. Ann Bot. 91, 5, 503-507.

[13]王宝山. 植物液泡膜质子泵的研究. 植物学通报, 1997, 14: 25-30.

[14]李焕勇, 杨秀艳, 唐晓倩等. 植物响应盐胁迫组学研究进展. 西北植物学报, 2016, 12: 2548-2557.

[15]姜琳, 王有婧, 周薇等. 植物抵抗盐胁迫的生理机制. 北方园艺, 2016, 23: 190-194.

1.拟解决问题

1.1设计目的基因的引物

1.2耐高盐酵母Nhx1基因的获取

1.3基因表达载体的构建导入及基因的表达

2.拟采用的研究手段

设计同源引物从筛到的耐盐酿酒酵母内扩增得到目的基因，到NCBI进行比对，同源率高，送去测序。随后构建基因表达载体，将NHX1基因导入不耐高渗的模式酵母BY4741内，随后在高渗条件进行培养，测定生长情况。

3.研究的意义

分析Na /H 逆向转运蛋白基因Nhx1对于盐胁迫的反应，研究Nhx1的生理及分子机制，不仅对揭示酵母耐逆的机理有重要的理论意义，而且对于耐盐酵母的培育，具有重要的实践意义。在酵母发酵某些产品的生产过程中，生产菌需要在高盐环境下持续发酵，因此研究酵母的耐高盐基因，从而找到提高生产菌的耐高盐能力的方法也具有很好的实用意义。