摘 要

人表皮生长因子简称hEGF (human epidermal growth factor)，是一种由机体细胞合成和分泌的小分子多肽类物质。 Escherichia coli(pET-22b-hEGF) 是本实验室构建的可高效表达人表皮生长因子（hEGF）的菌株。本研究采用摇瓶发酵对工程菌的发酵工艺进行优化，以大幅提高可溶hEGF产量。在实验中通过控制单个影响因素的方法，分别对培养基成分、诱导剂种类及浓度、诱导和发酵阶段条件包括温度和时间等促进或抑制表达效果进行考察，并确定最佳培养条件组合。最终实验结果表明：在30 mL摇瓶发酵中添加1 mL种子液，培养基组分为：葡萄糖浓度5 g/L，甘油7 g/L，酵母粉20 m g/L，磷酸氢二钾14 g/L，磷酸氢二钾6 g/L，氯化钠0.5 g/L；诱导剂选用乳糖，浓度为0.5 mM，在37℃先培养繁殖2.5 h，在20℃发酵16.5 h所得到的hEGF产量最高，为214±2 mg/L，且活性较好。

关键词：重组大肠杆菌 人表皮生长因子 诱导剂 温度

Optimization of Preparation of Recombinant Human Epidermal Growth Factor Expressed in Escherichia coli

Abstract

Human epidermal growth factor referred to as hEGF is a body cell synthesis and secretion of small molecules of peptide substances. Escherichia coli (pET-22b-hEGF) is a strain designed to express human epidermal growth factor (hEGF) efficiently in our laboratory. In this study, the fermentation process of engineering bacteria was optimized by shake flask fermentation to improve the yield of soluble hEGF. In the experiment, the effects of the factors such as temperature and time on the expression of the culture medium, the type and concentration of the inducer, the induction and fermentation stage were investigated, and the optimal culture conditions were determined. The final experimental results showed that 1 mL seed solution was added into the 30 mL shake flask fermentation. The medium components were: glucose concentration 5 g/L, glycerin 7 g/L, yeast powder 20 mg/L, dipotassium hydrogen phosphate 14 g/L,Dipotassium hydrogen phosphate 6 g/L, sodium chloride 0.5 g/L; inducer using lactose, the concentration of 0.5 mM, 37 ℃ in the first breeding and breeding 2.5 h, 20 ℃ fermentation at 16.5 h yield hEGF yield was the highest 214 ± 2 mg / L, and the activity is better.

KeyWords: Escherichia coli; human epidermal growth factor; inducer; temperature

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1人表皮生长因子简介 1

1.1.1 hEGF的结构与生理功能 1

1.1.2 hEGF的生产现状 1

1.1.3 hEGF的研究现况和展望 2

1.2重组大肠杆菌制备hEGF的影响因素 2

1.2.1培养基成分及比例 2

1.2.2诱导剂种类及浓度 3

1.2.3时间 3

1.2.4温度 3

1.3工业化及市场现状 4

1.4目的与意义 4

第二章 材料与方法 5

2.1材料与设备 5

2.1.1主要试剂 5

2.1.2仪器与设备 6

2.1.3实验菌种 6

2.1.4培养基配方 6

2.2实验方法 7

2.2.1 E.coli制备hEGF的单菌落活化 7

2.2.2 E.coli制备hEGF的种子液培养 7

2.2.3 E.coli(pET-22b-hEGF)生长曲线的绘制 7

2.2.4摇瓶初试工程菌制备hEGF 7

2.2.5富集大肠杆菌菌体及破碎细胞 8

2.3分析方法 8

2.3.1分光光度法测定菌体生物量 8

2.3.2酶联免疫吸附法测定hEGF表达量 8

2.3.3tricine-SDS-PAGE定性检测hEGF表达效果 9

第三章结果与讨论 11

3.1E.coli(pET-22b-hEGF)生长曲线的绘制 11

3.2培养基对E.coli制备hEGF的影响 11

3.2.1碳源的筛选 11

3.2.2氮源的筛选 12

3.2.3无机盐的筛选 13

3.2.4复合碳源 15

3.3诱导剂对E.coli制备hEGF的影响 16

3.3.1 IPTG诱导剂对E.coli制备hEGF的影响 16

3.3.2乳糖诱导剂对E.coli制备hEGF的影响 16

3.4诱导和发酵时间对E.coli制备hEGF的影响 17

3.4.1发酵时间的确定 17

3.4.2诱导时长对E.coli制备hEGF的影响 18

3.5诱导和发酵温度对E.coli制备hEGF的影响 19

3.5.1发酵温度对E.coli制备hEGF的影响 19

3.5.2诱导温度对E.coli制备hEGF的影响 19

第四章 结论与展望 20

4.1结论 20

4.2展望 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 文献综述

1.1人表皮生长因子简介

表皮生长因子（Epidermal growth factor, EGF）是一种细胞活性物质。1962年，Cohen^[1]在提取和分离小鼠的颌下腺过程中首次发现这类表皮生长因子。1975年，研究人员在人的尿液中发现了EGF的存在。1979年，Carpenter等^[2]发表了EGF的氨基酸残基组成报道，而Gregory^[3]发现了人类尿液中可以抑制胃酸分泌的胃抑素实质与EGF相同。1986年，Cohen由于在研究EGF领域中做出的杰出成果获得了诺贝尔医学与生理学奖^[4]。

人表皮生长因子（Human epidermal growth factor , hEGF）是一种广泛存在于人类皮肤细胞的小分子多肽，分子质量为6.2ku，有53个氨基酸活性肽。hEGF可利用基因工程技术合成，促进多种细胞分裂生长，合成结构和功能活性与天然hEGF高度一致。

1.1.1 hEGF的结构与生理功能

来源不同的EGF结构存在些微差异，一般同源性在70%。自然生物体中含有的hEGF属于生长因子中的一种无法透析的多肽单链，总共包含了53个氨基酸残基。hEGF中存在3个链内二硫键，由6个半胱氨酸使其整体构象在6~20位、14~31位和33~42位氨基酸序列之间形成三个环^[5，6]，这些环状结构可以起到稳定hEGF物化性质的作用，有助于发挥hEGF的生物活性。

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