1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1.概述

纳米技术是指在纳米尺度范围内，操纵原子、分子或原子团、分子团，使它们重新排列组合, 创造具有特定功能的新物质，或对某物质进行研究，掌握其原子和分子的运动规律和特性的崭新高技术学科，它的发展开辟了人类认识世界的新层次^[1]。纳米科技和生命科学是21世纪最前沿的两大学科，纳米技术的介入为生命科学的研究提供了无穷的想象空间。人体内所发生的生命活动或生物反应都需要酶的参与，以提高效率^[2]。而体内的酶大多不是自由状态存在，它们或是溶解于细胞质中，或是与各种膜结构结合在一起，或是位于细胞内其他结构的特定位置上，发挥其独特的生物催化性能。因此，以纳米材料为载体组装酶，体外模拟生命活动，研究酶生物催化行为，构建以酶为基础的纳米生物反应器和生物传感器已引起人们越来越大的兴趣^[3-5]。

2.纳米材料及其发展

纳米材料是指三维空间尺寸至少有一维处于纳米级（通常为1-100 nm）的材料。由于纳米材料处在微观世界和宏观物体的临界区，属于典型的介观系统。因此它显示出许多不同于常规材料的特殊性能，如纳米材料具有的表面效应、宏观量子隧道效应、量子尺寸效应、小尺寸效应和介电限域效应^[6,7]。

石墨烯是一个原子厚度的二维碳纳米材料，由于其高的比表面积，显著的导热性和优良的光电性能，受到了越来越多的研究者的关注，这些独特的性质是的石墨烯在电子器件，传感器和能量储存等领域得到了广泛的运用^[8]。

图1 石墨烯

石墨烯的巨大表面积取决于它的固体表面而大部分的多孔碳材料表面积是有大量的孔隙所贡献。但是，石墨烯由于范德华力的作用往往会不可逆的团聚甚至形成石墨，这就导致了石墨烯的表面积急剧下降。 许多研究人员试图设计出在石墨烯片层之间引入间隔来阻止石墨烯的团聚的材料这些材料有炭黑^[9]、碳纳米管^[10-14]、碳纳米纤维^[15]、金属氧化物^[16,17]、金属氢氧化物^[18,19]等。多孔石墨烯材料由于其独特的多孔结构和石墨烯本省的优良性质在运输或储存电子、离子、气体和液体上有着极大的优势^[20,21]。

随着科学技术的不断发展，纯石墨烯片的性能已经不能满足某些应用的特殊要求。相比原来的石墨烯片，多孔石墨烯材料表现出优异的性能为应用在电化学器件（超级电容器、锂离子电池、燃料电池，传感器，气体分离/储存和吸油。众所周知，多孔石墨烯材料可以分类根据孔径的微孔（孔径小于2 nm的中孔（2 nm），lt;lt;孔径小于50 nm），和/或大孔（孔径大于50 nm）^[22]通常，石墨烯筛有特定表面积（SSA）-孔隙尺寸范围从几埃到纳米尺度，褶皱的石墨烯具有中孔或大孔结构，和石墨烯泡沫具有大孔结构。

因此发展多孔石墨烯的挑战依然存在，如：（i）精确控制孔的形状、大小和功能，以满足应用的要求（ii）保持结构的稳定性和高导电性，（iii）选择大规模、低成本的合成方法。

3.制备石墨烯泡沫的方法

石墨烯的制备方法主要有模板法、溶胶-凝胶法、水热法、以及核沸腾法。

3.1模板法

模板法合成石墨烯泡沫依赖于各种无机或有机纳米材料作为模板，通过控制纳米模板材料的性质可以制备指定大小和形态的石墨烯泡沫。^[23]

模板法合成纳米材料与直接合成相比具有诸多优点，主要表现在：①以模板为载体精确控制纳米材料的尺寸和形状、结构和性质；②实现纳米材料合成与组装一体化，同时可以解决纳米材料的分散稳定性问题；③合成过程相对简单，很多方法适合批量生产。

模板法根据其模板特性的不同分为软模板法和硬模板法两种。两种方法都能提供一个有限大小的反应空间不同的是软模板法提供的是处于动态平衡的空腔，物质可以透过腔壁扩散进出；而硬模板法提供的是静态的孔道，物质只能从空隙开口处进入孔道内部。

3.1.1软模板法制备纳米材料

软模板一般都是由表面活性剂分子聚集而成。主要包括两亲分子形成的各种有序聚合物，如液晶、囊泡、胶团、微乳液、自组装膜以及生物分子和高分子的自组织结构等。这类模板是通过分子间或分子内的弱相互作用形成一定空间结构特征的簇集体。这种簇集体具有明显的结构界面，正是通过这种特有的结构界面使无机物的分布呈现特定的趋向，从而获得特异结构的纳米材料。软模板在制备纳米材料时的主要特点有：①由于软模板大多是两亲分子形成的有序聚集体，它们最大的特点是在模拟生物矿化方面有绝对的优势；②软模板的形态具有多样性；③软模板一般都很容易构筑，不需要复杂的设备。但是软模板结构的稳定性较差，因此通常模板效率不够高^[24]。

3.1.2硬模板法制备纳米材料

硬模板是指以共价键维系特异形状的模板。如具有不同空间结构的高分子聚合物、阳极氧化铝膜、多孔硅、金属模板天然高分子材料、分子筛、胶态晶体、碳纳米管和限域沉积位的量子阱等。与软模板相比，硬模板具有较高的稳定性和良好的窄间限域作用，能严格地控制纳米材料的大小和形貌。但硬模板结构比较单一，因此用硬模板制备的纳米材料的形貌通常变化也较少^[25]。

3.2溶胶-凝胶法

溶胶-凝胶法就是利用高化学活性组分的化合物作前驱体，在液相下将这些原料均匀混合，并进行水解、缩合化学反应，在溶液中形成稳定的透明溶胶体系，溶胶经过陈化胶粒间缓慢聚合，形成三维空间网络结构的凝胶。在氧化石墨烯水溶胶中加入掺杂物质形成混合液，得到掺杂的还原氧化石墨烯水溶胶混合液。氧化石墨烯水溶胶混合液静置数小时，用去离子水洗涤水凝胶混合液数次后，再经过冷冻干燥或超临界干燥，得到掺杂的还原氧化石墨烯泡沫。

3.3水热法

水热反应过程是指在一定的温度和压力下，在水、水溶液或蒸汽等中所进行的关化学反应。在水热条件下，水可以作为一种化学组分起作用并参加反应，既是溶剂又是矿化剂同时还可作为压力传递介质;将掺杂物质与氧化石墨烯在水热条件下充分混合，得到比表面积大，掺杂量高的石墨烯泡沫。

3.4核沸腾法

核沸腾是指发生在固体-液体界面上的一种传热形式。当固体与液体的温差ΔT达到一定值时，在固体表面上形成气泡，气泡增大到一定尺度就跃离固体表面，增加了液体的扰动，这时传热量大大增加，ΔT突然减小，这样就开始形成了界面上的核沸腾现象.石墨烯在加热表面上的沸腾沉积形成石墨烯泡沫。

4.微纳米限域空间中生物酶的催化性能

生命体中生物酶分子的尺寸在纳米级，它们通常在微纳米限域的空间或界面发挥其重要的生物催化功能。近年来，为充分发挥生物酶分子特有的催化性能，保持其生物活性，研究者们利用各种化学、材料及生物手段，体外构建人工限域生物传感器及生物反应器，模拟研究生命体内生物酶的催化活性及催化机制，并用于底物的代谢和微量物质的检测^[23-31]。与宏观体系相比，在纳米限域空腔中，同一时间内只能有数量有限的分子处于或通过该纳米空腔，纳米空腔中的分子与分子间相互作用以及分子与纳米材料间的作用几率增大，分子识别和反应动力学机制发生剧变，单分子行为变得更加明显。因此，利用限域纳米空腔可以研究生物分子的特殊性质，甚至单分子行为。认识纳米空腔内的单分子输运规律，将有可能在分子水平上探索生物分子识别与反应动力学机制，为认识复杂的生命活动过程提供依据。

图1-6 电化学纳米流控装置操作原理：通过固载的酪氨酸酶催化，将非活性的苯酚转化为电化学活性的醌，醌进行氧化还原循环，从而产生很强的电化学电流信号

Rassaei等^[32]构建了一个纳流控装置，并将酪氨酸酶固载在其只有6飞升的内部空间中。该装置同时结合了酶识别元件和电化学信号检测系统。在该限域空间里，通过电化学方法能够实时灵敏地检测微量的酶催化反应产物醌的存在，氧化还原反应循环过程能够有效地进行（见图1-6）。该研究体系非常适合于超小体积系统如单个生物细胞或细胞器含量的研究。Chang等^[33]合成了中空二氧化硅纳米球（HSN），该纳米球密度低，腔内空间较大，外壳多孔具有渗透性，适宜腔内组装酶，模拟细胞内生物催化反应。作者们利用反相微乳模版法在HSN腔内包埋的辣根过氧化物酶（HRP@HSN）保持很高的催化活性。与固载在二氧化硅纳米球表面的HRP相比，HRP@HSN 的催化活性更好，可以很好地将吲哚乙酸催化氧化为自由基，从而杀死癌细胞。

Liu等^[34]将脂肪酶包埋在FDU-12纳米笼中（见图1-7），通过硅烷甲基化对FDU-12进行两亲性修饰，可以很好分散在Pickering乳液中。结果表明，用FDU-12纳米笼包埋脂肪酶显示很强的酶催化活性，并且可有效防止酶流失。Ikemoto等^[35]以孔径为7.6 nm的SBA-15分子筛为载体，将HRP酶通过静电吸附的方式固定在孔道中，结果表明，室温情况下，受限酶对H₂O₂氧化苯酚反应的催化速率明显优于游离酶，对失活剂尿素的抗失活性能也比游离酶强。

Qian等^[36]开发了一种新型大孔二氧化硅泡沫（MSF，孔径约100 nm）的纳米反应器用于蛋白质水解研究，对293种蛋白质进行快速鉴别。通过静电吸附的方式将蛋白水解酶固定在纳米反应器中，由于MSF对溶液中蛋白质和酶的增浓效应，从而加速酶对蛋白质的水解，因而通过质朴分析法快速实现了多种蛋白质的鉴别。此外，他们用不同的其他物质对MSF进行修饰改性，并用于蛋白质的水解研究中去^[37-39]。同时他们从这些研究中归纳出改性的MSF具有以下三大功能：（1）MSF中大孔孔道用作酶催化反应的纳米反应器；（2）无需增加溶液中蛋白质或酶的初始浓度，也无需通过预固定，即可在孔道中实现蛋白质和酶的快速富集，从而加速蛋白质的水解消化；（3）由于MSF表面化学改性基团与所检测蛋白质的特异性基团之间存在化学亲和力，纳米反应器可以原位分离酶促反应的特异性产品，并将非特异性多肽排到溶液中。

图1-7 FDU-12纳米笼封装酶过程示意图

利用在纳米限域空腔中固载酶可以构建生物传感器，如以多孔二氧化硅和氧化铝作为载体，在其孔道中固定不同种类的酶，制备酶传感器。Dai等^[40]将葡萄糖氧化酶（GOD）固定在介孔二氧化硅孔道内制备成葡萄糖电化学传感器。研究表明，GOD不仅表现出很好的直接电化学性能，还很好地保持其生物活性，当以羧基二茂铁为电子媒介体时，该传感器对葡萄糖的检测线性范围为0.32-15.12 mM L^-1。为提高介孔二氧化硅泡沫的导电性，增强电子传递能力，Wu等^[41]成功合成了介孔碳-二氧化硅泡沫，并以其作为载体固定GOD在其通道内，制备了葡萄糖传感器。Xia等^[42,43]等利用溶胶-凝胶法一步将HRP或GOD酶包裹在三维二氧化硅孔道中，制备电化学酶传感器。具体讲，他们采用电化学方法将酶包覆在多孔二氧化硅中，并同时将其固定在电极上，在电解过程中产生的-OH使二氧化硅前驱体水解生成二氧化硅，而产生的H₂则使水解生成的二氧化硅产生孔道（如图1-8）。Piao等^[44]在介孔二氧化硅孔道中固定GOD和胰蛋白酶（TR），并在孔道中将酶于抗体以共价键合的方式与IgG抗体（anti-IgG）相结合，标记在抗小鸡IgG（cIgG）和抗人IgG（hIgG）上，制备了检测IgG的免疫传感器。

图1-8 电沉积形成多孔二氧化硅实验流程示意图

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1.研究的问题

细胞色素p450酶（cyp450）是一组含有亚铁血红素蛋白的酶，又称混合功能氧化酶和单加氧酶，主要位于肝微粒体中，参与许多内源性和外源性物质的生物转化过程，超过60%的临床药物的代谢是由cyp450酶系完成的^{[139, 140]}。在药物代谢反应中，由cyp酶催化的i相反应是药物在体内代谢的关键步骤，因为这一步反应常常是药物从体内消除的限速步骤，机体内cyp酶代谢活性的高低决定药物在体内药效的强弱^[141]。细胞色素p450酶可催化很多反应，包括环氧化反应, n-去烷基化, o-去烷基化, s-氧化及脂肪族和芳香族残基的羟化反应等^[139]。cyp450的活性代谢产物会与dna、蛋白质，或者其他的生物分子引起毒性反应^[142]。因而，研究药物的cyp酶代谢过程，检测代谢后的产物能否与dna、蛋白质形成加合物或引起dna的损伤，可以为评价该药物对酶代谢系统的抑制及其基因毒性，指导新药的设计和合成提供依据，对于人类健康具有重要的现实意义和实践价值。

鉴于在药物代谢及生物合成方面具有很大的潜在应用，从上个世纪70年代起，研究者们就进行了大量的在体外研究细胞色素p450酶催化性能的相关工作。但是所有这些研究工作不得不面对这样的困难：cyp/cpr/nadph多酶催化体系稳定性有限，需要使用辅酶nadph作为电子供体，以及依赖还原酶作为电子载体。近年来已有相关报道改用其它辅助因子系统代替nadph以克服这些困难和避免繁琐的nadph再生工作^[143-146]。如使用电极提供电子源，实验证明这是在体外模拟cyp450酶催化代谢的一种经济高效的方法。