摘 要

苯并噁唑酮(BOA)是一类重要的含氮稠杂环化合物，具有杀菌、除草等作用，所以在农药开发中具有举足轻重的作用，但由于此类化合物具有对动植物有很大的毒害性且很容易残留在土壤中，合理降解就显得格外重要。本文根据前期工作筛选到BOA高效降解菌株Pigmentiphaga sp. DL-8，并通过生物信息学方法鉴定了参与BOA降解过程的关键酶BOA水解酶CbaA和2-氨基苯酚（2AP）降解基因簇cnb为基础，在本研究中进一步以菌株DL-8基因组为模板，成功克隆并异源表达了2AP双加氧酶编码基因cnbC_αC_β，并对其酶学性质进行表征。结果表明：cnbC_αC_β由684 bp和945 bp的α、β两个亚基组成，将其在大肠杆菌BL21(DE3)中成功实现异源表达并通过亲和层析进行纯化，SDS-PAGE显示获得电泳纯重组rCnbC_αC_β；rCnbC_αC_β的米氏常数(K_m)为0.92 μM，最大反应速率(V_max)为38.7 μmol·min^-1·mg^-1，最适反应温度为40℃，最适反应pH为7.5，但该酶对环境条件（温度、pH、化学试剂等）稳定性较差。

关键词：苯并噁唑酮 微生物降解 Pigmentiphaga sp.DL-8 酶学性质

Cloning and expression of 2-aminophenol dioxygenase gene involved in benzoxazolone degradation

Abstract

Benzo-oxazolone (BOA) is a kind of important nitrogen-containing fused heterocyclic compounds, with sterilization, weeding and so on, so in the development of pesticides plays a decisive role, but because of such compounds have a great animal and plant Toxic and easy to remain in the soil, a reasonable degradation is particularly important. Based on the preliminary work, the BOA-degrading strain, Pigmentiphaga sp. DL-8, was screened by bioinformatics method. The key enzymes involved in the BOA degradation process were identified. The CABA and 2-aminophenol (2AP). In this study, the gene of the DL-8 genome was used as template to successfully clone and express the 2AP double oxygenase gene cnbC_αC_β, and its enzymatic characterization was carried out. The results showed that cnbC_αC_β consisted of α and β subunits of 684 bp and 945 bp.They were successfully expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and purified by affinity chromatography (Km) was 0.92 μM, the maximum reaction rate (Vmax) was 38.7 μmol •min^-1•mg^-1, the optimum reaction temperature was 40℃, and the maximum reaction rate (Vmax) was 38.7 μmol•min^-1•mg^-1, the optimum reaction temperature was 40℃, The optimum pH was 7.5, but the enzyme had poor stability to environmental conditions (temperature, pH, chemical reagents, etc.).

Key Words: Benzoxazolone; Microbial degradation; Pigmentiphaga sp.DL-8; Enzymatic properties

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 前言 1

第二章 文献综述 2

2.1 苯并噁唑酮简介 2

2.1.1 苯并噁唑酮的理化性质 2

2.1.2 苯并噁唑酮的作用 2

2.2 苯并噁唑酮及其衍生物的危害 2

2.3 苯并噁唑酮的微生物降解机制 3

第三章 材料与方法 5

3.1 材料 5

3.1.1 菌株、质粒以及引物 5

3.1.2 培养基以及试剂 5

3.2 方法 6

3.2.1 Pigmentiphaga sp. DL-8中的2AP双加氧酶基因挖掘 6

3.2.2 2AP双加氧酶基因cnbC_αC_β的克隆和基因重组表达菌株的构建 6

3.2.3 重组酶 CnbC_αC_β的诱导表达 9

3.2.4 CnbC_αC_β粗酶的亲和层析纯化 9

3.2.5 2AP双加氧酶CnbC_αC_β的米氏常数(K_m)和最大反应速率(V_max) 10

3.2.6 温度和pH值对重组酶CnbC_αC_β活性和稳定性的影响 10

第四章 结果与讨论 11

4.1 2AP代谢基因簇的挖掘 11

4.2 2AP代谢的关键基因cnbC_αC_β的克隆表达和重组表达菌株的构建 11

4.3 重组酶CnbC_αC_β的诱导表达和纯化 12

4.4 2AP双加氧酶CnbC_αC_β的米氏常数和最大反应速率 12

4.5 温度和pH对2AP双加氧酶CnbC_αC_β活性的影响 13

4.6 金属离子对2AP双加氧酶CnbC_αC_β活性的影响 14

4.7 表面活性剂、螯合剂和有机溶剂对2AP双加氧酶重组酶rCnbC_αC_β活性的影响 15

4.8 讨论 15

致 谢 16

参考文献 17

第一章 前 言

在科学技术、人民生活水平、经济消费水平等日益发展的今天，人口的增长所导致粮食食品的缺乏仍然是令全世界关注的最大问题。若要保证粮食充足，需要考虑多种措施的配合，其中比较简单、现实可控的方法之一是对农作物进行农药处理，也就是尽可能的减少由于病虫、杂草等危害所造成的的农作物减产。因此，在一个相当长的时间里，人类开始大量广泛的运用农药，但由于农药的过分运用以及在此之前并没有考虑运用的结构是否合理，导致我国的农业生产环境不断恶化^[1]。在2015年，我国的粮食产量实现了“十三连增”，粮食产量虽然不断增长，我国农药滥用所导致的生态环境污染问题也日益被人们所关注^[2]。

苯并噁唑酮（BOA）是一类重要的含氮稠杂环化合物，它不仅可以消灭有害菌、除草、也可以消灭有害昆虫，同时它又有选择性好，内吸性高，结构多样等特点，所以在过去的很长一段时间被广泛应用于农业生产中。同时，也在新型医药制剂研究中常被用作重要的结构组成单元，起重要的作用，例如镇痛类药品氯唑沙宗、除草剂精噁唑禾草灵和噁唑酰草胺、杀虫剂伏杀硫磷等。BOA的残留物对下茬作物或其他经济作物的萌发和生长存在剂量-抑制效应，甚至影响高等植物的能量代谢，造成土壤连作障碍^[3]。有研究表明BOA可以降低幼苗长度、影响植物形态特征和胚根细胞的分裂^[4]，甚至在成熟植株代谢中对其造成氧化损伤^[5]。BOA残留已经带来严重的农业土壤污染问题，利用BOA降解菌对其进行生物修复将成为有效手段。因此，微生物对BOA的降解机制近年来成为研究热点，本论文在实验前期经过富集获得一株可以完全降解BOA及其衍生物（5-氯BOA、6-氯BOA、6-甲氧基-BOA等）的细菌Pigmentiphaga sp. DL-8。鉴于菌株DL-8可能成为BOA土壤污染的潜在修复者，因此需要对BOA降解的关键酶基因进行克隆，实现基因在大肠杆菌中的异源表达，为合理降解BOA提供更加广阔的研究方向^[6] 。

第二章 文献综述

2.1苯并噁唑酮简介

2.1.1苯并噁唑酮的理化性质

苯并噁唑酮是分子式：C₇H₅NO₂，熔点137至141℃，沸点:299℃，折射率：1.586，密度1.323 g/cm³,溶于热水，是一类重要的含氮稠杂环化合物。

2.1.2苯并噁唑酮的作用

苯并噁唑酮生理活性的主要原因是它与亲核试剂的反应，这种反应可以引起突变作用^[7]。与此同时，苯并噁唑酮也可以和氨基酸衍生物进行反应，进行蛋白质修饰，这类反应是它在现实生活中用于植物杀菌、杀虫、除草的主要原因之一。

苯并噁唑酮类衍生物在人类日常生活中的利用主要有两方面。其一是用于新型农药开发来研究。常用的农药中，噁唑禾草灵、恶唑酰草胺、伏杀硫磷等，是已经生产商品化的农药品种^[8]。这也是本论文研究的基础，是因为正是由于苯并噁唑酮类农药的滥用使得生态环境平衡被破坏，而微生物对有害农药降解具有独特优势，使得苯并噁唑酮可以在农业生产中被继续使用，也不会因为滥用产生对环境的负面影响。其二是它在医药方面也有重要的作用^[9]。这是因为苯并噁唑酮类衍生物具有抗炎、抗菌和骨骼肌松弛等效果^[10,11]。除此之外，也有研究报道称，它对于抗病毒、抗HIV也有良好的作用效果。目前在此类中运用广泛的如5-氯-2-苯并噁唑酮，是已经上市了的具有优良作用的肌肉松弛药，也叫氯唑沙宗^[12]。

2.2苯并噁唑酮及其衍生物的危害

随着对苯并噁唑酮类衍生物的需求不断增加，给生态环境也造成了不可估量的劣势影响。例如日常生活中不可缺少的化学农药，因为有除草、除虫等优点，以至于在农作物培植中大量使用，粮食产量在一定的时间内获得了巨大的收益，但时间长久，不仅是产生抗药性缩短产品的使用时间，更多的是对环境生态平衡的损害，我国一直是一个农业大国，13亿人口的吃饭问题一直是最基本的国计民生，因此解决好农药问题势在必行，也亟待解决。农药既不能不用也不滥用，需要慎重平衡关系^[13,14]。本文所研究的苯并噁唑酮及其衍生物为主的农作物对环境的危害主要是由于苯并噁唑酮衍生物残留下的对下茬作物或者其他经济作物的萌发和生长存在着剂量-抑制效应，也可能会影响高等植物的能量代谢，使土壤连作产生障碍^[15]。有研究表明，苯并噁唑酮可以降低幼苗长度，影响植物形态特征和胚根细胞的分裂，甚至会对成熟植株的代谢产生一定的氧化损伤^[16]。不仅如此，苯并噁唑酮类衍生物会对土壤生物、水生生物、哺乳动物均带来严重危害。例如，精噁唑禾草灵可以抑制在土壤中生长的放线菌、细菌以及真菌的生长，它也会降低土壤中脲酶、过氧化氢酶以及蔗糖酶的活力^[17]。

2.3苯并噁唑酮的微生物降解机制

微生物被用作农药的降解已经是非常常见的了，微生物中细菌适应能力强并且容易诱发突变菌株，被运用的比例相对于其他几类更高。运用细菌来降解农药主要是依靠酶促反应，这类反应主要是在各种酶的作用下，将化合物分解成分子量较小的、无毒或者毒性较小的化合物的过程^[18]。