摘 要

我的实验项目是基于酶促法合成药用寡肽自组装水凝胶。短肽水凝胶主要是通过非共价键的作用以高度有序的方式进行自组装并自发形成纳米纤维，因此它们是可以注射的并且具有生物可降解性。

在我们实验室筛选出的新型嗜热金属蛋白酶WQ9-2可以高效率地催化特异性前体之间胶凝剂的合成。通过酶的生物催化，使短肽Phe-Phe和Fmoc-Leu通过自组装以实现水凝胶的形成，并完成了一系列水凝胶的体外表征实验包括SEM，动态时间扫描模型、荧光发射光谱表征和HPLC分析等等。本实验选择DOX(阿霉素)作为模型药物加载到水凝胶中，并通过溶出实验绘制药物释放曲线表征载药水凝胶的安全性能。小分子水凝胶是具有稳定的生物安全性的亲水软材料，常用于药物的缓控释系统。利用酶触发合成水凝胶也是本论文研究的重点内容。

关键词：纳米材料 水凝胶 酶促法 嗜热蛋白酶WQ9-2 小肽

Enzymatic formation of a novel hydrogel based on shortpeptides.

Abstract

My experimental project is Enzymatic formation of a novel hydrogel based on shortpeptides. Short peptide hydrogels are self-assembled by non-covalent bond in an ordelly manner, spontaneously forming nanofibers , thus they are injectable and biodegradable.
A new enzyme, WQ9-2 screened in our lab could catalyze the gelator synthesis between specific precursors with high efficiency, Through the catalysis of the enzyme, the small peptide Fmoc-Leu and Phe-Phe were self-assembled to realize the synthesis of hydrogels, And complete a series of in vitro characterization experiments of hydrogels.We chose Doxorubicin as a model drug to be loaded into the hydrogel, then performed the characterization including SEM, dynamic time sweep model and flurescence spectroscopy, HPLC and so on.it is a promising biomaterials for controlled drug release.

Small molecule hydrogel is a kind of biological material with good compatibility, which can be used for drug -controlled- release . It is the focus of current research and the focus of this paper.

Key Words: Nanofiber; Hydrogel; Enzyme；small peptide

目录

摘要 I

Abstract II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1小分子水凝胶的研究进展 1

1.2 智能药物递送系统的发展 2

1.3 生物催化剂在水凝胶形成过程中的应用 3

1.4蛋白酶在触发肽类水凝胶中的用途 3

1.5实验目标、内容及技术路线的简介 4

1.5.1研究目的 4

1.5.2研究内容 4

1.5.3 研究技术路线 4

第二章 蛋白酶的分离纯化与克隆表达 6

2.1前言 6

2.2实验材料 6

2.2.1菌株 6

2.2.2试剂与仪器 6

2.2.3培养基配方 7

2.3实验方法 7

2.3.1蛋白酶WQ9-2的克隆表达 7

2.3.2蛋白酶WQ9-2的分离与纯化 7

2.3.3验证以及测定蛋白酶活力 8

2.3.4蛋白酶的分离纯化 8

2.4结果与讨论 9

2.4.1重组菌发酵产酶曲线 9

2.4.2蛋白酶WQ9-2的纯化及性质研究 10

2.4.3 SDS-PAGE蛋白浓度测定结果 10

第三章小分子基元的设计及酶促自组装小肽水凝胶 11

3.1 前言 11

3.2 实验材料 11

3.3 试验方法 12

3.3.1设计小分子基元及酶触发水凝胶自组装 12

3.3.2最低成胶浓度的确定 12

3.3.3水凝胶的表征实验 12

3.3.4载药水凝胶的构建及溶出实验 13

3.4结果与讨论 13

3.4.1最低成胶浓度 13

3.4.2 电镜表征水凝胶的空间结构 13

3.4.3发射光谱表征成胶 14

3.4.4 HPLC分析产物转化 15

3.4.5 DOX药物释放曲线 15

3.4.6 BSA药物释放曲线 17

第四章结论与展望 18

4.1结论 18

4.2项目创新特色概述 18

4.3展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

近年来，寻找稳定安全的生物催化剂已日渐吸引了医药行业研究者浓厚的兴趣，蛋白酶作为一种新型生物催化剂在活性多肽的合成的作用也为这个行业提供了独特的思路^[1]。因此利用酶催化形成具有良好的生物相容性和生物可降解性的水凝胶不仅象征着科学研究的进一步发展，也对医药工程方面的建设具有非凡的现实意义。

1.1小分子水凝胶的研究进展

水凝胶是一种在水中只会溶胀而不会溶解，内部空间能够大量固定水分子的软材料^[2]。在生活中的应用包括面膜、隐形眼镜，手术粘合剂等等。根据其对环境刺激响应的不同，水凝胶可以分为传统水凝胶和智能水凝胶^[3]。常见的包括温（热）敏、光敏、pH、电解质、电场响应、形状记忆水凝胶等等^[3,4]。近年来，智能水凝胶在药物控释缓释方面的研究受到了极大的关注，也取得了许多研究成果，这也必将推动智能给药系统的发展^[3]。

小分子化学是研究分子聚集体和分子间相互作用的一门化学^[6]。 小分子水凝胶是指小分子在溶剂中通过非共价键如氢键、π－π共轭等分子间相互作用力结合在一起形成的具有三维网状结构的纤维材料^[3]。小分子水凝胶的特点是能对外部环境条件的变化迅速做出反应,这使其在细胞工程、再生医学、膜材料以及控制药物释放等研究领域发挥了巨大的用途^[5]。小分子水凝胶中的小分子通常是由疏水性和亲水性的芳基或长碳链两部分组成^[3]，其中亲水部分为分子与水提供了必要的相容性，而疏水部分产生的疏水相互作用力则被认为是小分子自组装的主要驱动力^[7]。我们可以将小分子水凝胶的结构与蛋白质的各级结构进行类比，其中三级结构决定了蛋白质的空间结构，而相对于小分子水凝胶而言他也是决定水凝胶最终是形成凝胶还是形成沉淀的关键因素^[7]。如图1-1、1-2为普通智能水凝胶和小分子水凝胶空间结构的区别^[8,9]。

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