摘 要

大肠杆菌（Escherichia coli）是引起人、畜急性腹泻的主要病原体^[1]。金黄色葡萄球菌是引起食物污染和食源性细菌污染的主要病菌，其中肠毒素SEB又是引起金黄色葡萄球菌食物中毒的关键因素。因而在提高食品的安全性的工作中，建立高效、准确、灵敏的大肠杆菌和肠毒素SEB检测方法就显得尤为重要。

核酸适配体具有高特异性、易修饰、高亲和力等优良特性，在生物、制药、材料等科学领域被广泛的应用、研究。在食品检测方面，跟传统的检测方法比较，电化学生物传感器方法则具备灵敏度高、反应迅速、实验设计简易、操作简单、价格成本较低等优点。本论文研究了构造U型核酸纳米探针同时对大肠杆菌和肠毒素SEB的检验检测，并且对其电化学性能调控。用亚甲基蓝（MB）和二茂铁（Fc）作为电化学活性物质，构建核酸适配体电化学生物传感器：

利用DNA退火原理组装U型核酸纳米探针，然后将组装好的U型结构固定于纳米金电极表面，构建电化学生物传感器，实现高灵敏度、微量、快速检测，并针对U型结构在金电极表面易坍塌、信号不稳定的难题，可添加巯基乙醇（MCH）辅助U型结构的方向固定。

关键词：大肠杆菌 肠毒素 核酸适配体 生物传感器 同时检测

Preparation of U-type Nucleic Acid Nanoparticle Probe and Its Electrochemical Performance Regulation

Abstract

E．coli is the main pathogen causing acute diarrhea in humans and animals ^[1]. Staphylococcus aureus is the main pathogen causing food contamination and food-borne bacterial contamination. Enterotoxin SEB is also a key factor in food poisoning caused by Staphylococcus aureus. Therefore, in the work of improving food safety, it is particularly important to establish an efficient, accurate and sensitive detection method for E. coli and SEB.

Nucleic acid aptamers have excellent properties such as high specificity, easy modification, high affinity, and are widely used and studied in the fields of biology, pharmacy, and materials. In terms of food detection, compared with traditional detection methods, electrochemical biosensor methods have the advantages of high sensitivity, rapid response, simple experimental design, simple operation, and low cost. In this dissertation, the U-nucleic acid nanoprobe was constructed and the E.coli and enterotoxin SEB were detected and detected, and their electrochemical properties were regulated. The use of methylene blue (MB) and ferrocene (Fc) as electrochemically active substances for the construction of aptamer bioelectrochemical biosensors:

The assembled U-shaped structure is fixed on the surface of the nano-gold electrode, and an electrochemical biosensor is constructed to realize high-sensitivity, trace, and rapid detection, and the U-shaped structure is easy to collapse on the surface of the gold electrode and the instability of the signal can be added. The direction of the ethanol (MCH)-assisted U-shaped structure is fixed.

Keywords: E.coli, SEB, aptamer biosensor, simultaneous detection

目录

摘要 I

Abstract II

第一章绪论 1

1.1大肠杆菌简介 1

1.1.1大肠杆菌概述 1

1.1.2大肠杆菌污染及限量情况 1

1.1.3 我国对于大肠杆菌的限量情况 2

1.1.4大肠杆菌检测方法 2

1.2肠毒素（SEB）简介 2

1.2.1肠毒素(SEB)概述 2

1.2.2肠毒素检测方法 3

1.3核酸适配体简介 3

1.3.1核酸适配体概述 3

1.3.2核酸适配体的优势 4

1.3.3适配体的应用 4

1.4生物传感器简介 5

1.4.1生物传感器工作原理 5

1.4.2电化学生物传感器中的信号放大策略 6

1.4.3电化学生物传感器多组分检测相关研究进展 6

1.5论文研究思路 6

第二章 实验部分 8

2.1实验原理 8

2.2试剂 9

2.3U型核酸纳米探针的制备及电极修饰 9

2.4核酸适配体与靶物质特异性结合 10

2.5仪器和测量 10

2.6实验的条件优化 11

2.6.1实验试剂优化 11

2.6.2靶物质检测浓度优化 12

2.6.3孵育时间的优化 12

第三章 结果与讨论 14

3.1实验试剂优化 14

3.2U型核酸纳米探针的信号检测 15

3.3关于靶物质最佳检测浓度优化 16

3.4关于孵育时间的优化 17

第四章 结论与展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献： 20

致谢 23

第一章 绪论

1.1大肠杆菌简介

1.1.1大肠杆菌概述

大肠埃希氏菌（E.coli）通常被称为大肠杆菌，是埃希氏菌属的代表菌种之一。大肠杆菌具有鞭毛提供动力，属于兼性厌氧菌，是典型的革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是人和动物肠道中的长居菌，一般多不致病，少数致病的是由于其能产生或者携带致病因子、肠毒素、抗原、带有菌毛或者可产生内毒素。致病性大肠杆菌可以根据生物学特性分为六类^[2]：ETEC、DAEC、EIEC、EPEC、EAEC、EHEC。大肠杆菌致病一般是由于宿主免疫性下降，一些正常的大肠杆菌可能会变成条件致病菌因而引起机体被感染，如：宿主受到外伤，体内免疫竞争平衡状态被打破，肠腔内的大肠杆菌进入腹腔或血液引起感染。

1.1.2大肠杆菌污染

（1）生物体污染

致病性大肠杆菌主要以动物为传染源，其引起的疾病通常属于人畜共患病，如常见的牛、猪、鸡、羊等宰前感染^[3]。大肠杆菌常于家畜及其奶中，被家畜粪便污染了的水中，以及用被污染了的水灌溉的农作物中也会被检出。人们食用了这些被污染过的食品，就可能引发腹泻等病症。在世界范围内，严重的大肠杆菌感染事件几乎都是由食物传播导致。在屠宰与食物加工过程中，带菌禽肉加热不彻底或生吃都会导致进食者感染。

（2）环境污染