摘 要

为针对性解决纳米剂型在肿瘤治疗的应用中表现出的生物相容性差、靶向性较弱、定点释放能力缺乏等功能性问题，本论文拟运用具有生物相容性良好、pH敏感特性等诸多特点的聚多巴胺（polydopamine，PDA）对纳米剂型进行表面功能修饰为大方向，进行pH响应型聚多巴胺载药纳米球的制备、表征以及体外释药研究。

本课题采用正交实验手法筛选聚多巴胺纳米球的最佳制备条件，以光敏剂二氢卟吩e6（Chlorin e6，Ce6）为被负载药物，运用纳米沉淀法制备出载药纳米球Ce6@PDA测试粒径以及电镜扫描观测包载状态；然后测试载药纳米球的载药率和包封率，并用体外pH环境模拟进行释药评价。为探究聚多巴胺是否具有辅助肿瘤光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）潜力，在808nm红外光下进行光热实验。

最终本课题结果表明通过沉淀法能够制备出粒径在200nm左右、并且其具有明显的pH敏感性和光热转换特性的聚多巴胺载药纳米球。本文旨在证明聚多巴胺作为良好药用料在纳米剂型应用中有突出优势，对针对聚多巴胺为基础的纳米球修饰研究有一定的实践意义。

关键词：pH响应型药物传递系统；聚多巴胺；载药纳米球

Abstract

In order to solve the functional problems such as poor biocompatibility, weak targeting and lack of fixed-point release ability in the application of nano-dosage form in tumor therapy,

In this thesis, polydopamine（PDA）, which has many characteristics, such as good biocompatibility and pH sensitivity, is used to modify the surface function of nano-dosage forms.

In this paper, orthogonal preparation method was used to screen the optimal preparation conditions of polydopamine nanospheres. The photosensitizer chlorin (Chlorin e6, Ce6) was used as the loaded drug, and the drug-loaded nanospheres Ce6@PDA was prepared by nanoprecipitation. The particle size and electron microscopy were used to observe the entrapped state. Then, the drug loading rate and encapsulation efficiency of the drug-loaded nanospheres were tested, and the drug release evaluation was carried out by in vitro pH environment simulation. To investigate whether polydopamine has the potential for photodynamic therapy (PDT) to perform photothermal experiments at 808 nm infrared light.

Finally, the results of this study indicate that polydopamine-loaded nanospheres with a particle size of about 200 nm and excellent pH sensitivity and photothermal conversion characteristics can be prepared by precipitation method. This paper aims to prove that polydopamine has outstanding advantages in the application of nano-dosage as a good pharmaceutical material, and has certain practical significance for the research of polydopamine-based nanosphere modification.

Key words: pH responsive drug delivery system; Polydopamine; Drug-loaded nanospheres

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第1章 绪论 1

1.1 课题目标 2

1.2 相关材料简介 3

1.2.1 pH响应及材料介绍 3

1.2.2 聚多巴胺（polydopamine，PDA） 3

1.2.3 二氢卟吩e6 5

1.2.4 载药纳米球 6

第2章 Ce6@PDA的制备 7

2.1 实验阶段安排 7

2.2 实验试剂与设备 7

2.3 制备条件确定 8

2.4 聚多巴胺纳米球体检测与表征 10

2.4.1 透射电镜（TEM） 10

2.4.2 光热效应实验 11

第3章 载药与释药测试 13

3.1 载药实验 13

3.2 Ce6紫外检测 13

3.3 Ce6@PDA载药纳米球的释药性能研究 15

第4章 结论 18

参考文献 20

致谢 23

第1章 绪论

在过去的数十年里，由于因为肿瘤去世的人数并未减少反而隐隐呈增长趋势，在人们谈瘤色变的紧张环境中，药剂学的发展和研究已经延伸至与之并行发展的医用纳米平台，其中载药纳米球以及功能修饰性的纳米级的药用新剂型在药物剂型的研究中被广泛关注。众所周知的是，目前针对肿瘤疾病我们的治疗大多仍是常规的手段大概包括药物治疗、化学治疗、免疫治疗以及光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）等^[1-2]，这些手段几乎都面临着在实施治疗过程中甚至治疗后对患者非病灶部位造成不可逆严重伤害这一不容忽视但同时有不可避免的事实，而且由于目前口服注射药物最为常用但是都不能够满足人体内靶向传递定点释放给药的要求，因此在药物递送过程中避无可避的会损伤我们机体正常的组织细胞等，在伤害机体其他部位的同时有效药物的量也会因为随着药物体内递送的过程泄漏大量减少，以至于到达肿瘤部位的药量不足更甚者低于有效治疗浓度不能达到预期的疗效，从用药疗效角度来考虑少不得要增大单次用药剂量，这就形成了一个多药恶性循环，在循环往复过程中，患者机体遭到破坏，免疫力大大减弱引起肿瘤扩散并且产生药物耐受性，一旦发生多药耐药只能又采以增大用药量和更换新药物的手段，长久以此病人无论是经济负担还是身体生理承受药物副作用负担都在不断的加强。为了有效解决以上问题，实现药物递送损失最小化在病灶部位浓度和疗效最大化，靶向药物传递系统的概念应运而生。

靶向药物传递系统是针对精准治疗而提出的概念，是指通过药物的改造修饰使药物具有与特定靶部位产生特异性结合的性质，降低药物传递和非靶部位的接触使药物能够有效分配到体内特定部位，从而减少副作用、改善多药耐药现象。靶向给药核心除了给药机理的构建，还在于选择药物的载体和筛选修饰载体的材料。经由大量的研究推进以及纳米医学平台的并行发展，靶向药物传递系统用药已经趋于成熟化并结合了纳米剂型给药构建纳米靶向给药系统^[2-3]。为能保证患者整体健康的前提条件之下祛除疾病，纳米剂型的多样性修饰运用赋予药物靶向功能以及药物定点释放是药物在体内过早释放产生强生物毒性的首要选择手段，该手段的实施要通过为纳米载体建立起生物刺激响应性能 。

为实现靶向给药构建的条件即使药物变成特殊配体或受体与体内的靶部位配体特异结合，我们针对肿瘤部位作出分析，我们已知人体肿瘤作为病灶部位由于某些物质过度表达，所以pH呈微酸性与人体健康组织血液环境呈弱碱性的较为明显的区别，正是得益于此，在保证药物能够靶向传递到达病灶部位并发挥作用的主旨之下，针对肿瘤的治疗便有了pH响应型纳米靶向药物传递系统，这一完整肿瘤针对系统概念。pH敏感同时

也叫pH刺激和pH响应，主要是基于肿瘤治疗大环境之下的探索，pH敏感型药物传递系统在理论上更容易实现靶向传递和药物定点释放。其中为了满足药物pH敏感特性的构建，需要能够包载治疗的目标药物并且本身能够满足有生物相容性良好、有pH敏感特性、对人体没有伤害的在人体内不会产生累积效应等条件的生物载药材料^[3-9]。

而聚多巴胺（PDA）是由单体多巴胺（DA）在相当温和条件下聚合形成的聚合体，因为多巴胺是人体正常产物之一那么由其聚合而成的聚多巴胺也具有对人体友好特性，因此聚多巴胺具制备方式便捷所需条件简单、生物相容性良好、无生物毒性、具有pH敏感特性、作为载药材料进入人体发挥传递作用后容易被机体降解而不会产生累积对人体造成药物应用的二次伤害的优良特性。使其能够应用到靶向纳米药物传递系统构建中药物修饰环节，并且已经有很多针对于聚多巴胺的纳米剂型能够增强肿瘤联合治疗的疗效的研究正在对聚多巴胺的优良特性进行强调说明，正是这些被人们已知或者正在探索的以及其独特的载药性能等优势而被应用于纳米球载药用的包载制备材料^[2-15]。

可以满足能包载目标治疗药物的生物友好材料-聚多巴胺已经被筛选出来，我们的目是构建能够在机体组织内部顺利传递并且传递过程中只有极少数药物泄露对机体组织没有毒害的具有定点释药特性的pH响应型聚多巴胺载药纳米传递系统^[2]。因此实验中主要探究聚多巴胺载药纳米球的制备方法以及针对成品做检测表征即可，本课题中用聚多巴胺纳米药物修饰手段，采用极为简单的方法制备并验证聚多巴胺是能够完成纳米药物载药修饰、而且能够靶向定点释放的具有pH响应的载药材料，为聚多巴胺应用以及pH响应靶向纳米载药系统的研究提供实践探索。

1.1 课题目标

正如以上所述，本课题所要研究的主要内容为：先通过研究测试制备以具有pH相应特征的的聚多巴胺作为载药材料包载目标药物制备载药纳米球体的合理条件包括合适的pH、丙酮和蒸馏水以及盐酸多巴胺的比例以及避光反应的时长用于验证试验制备方法的可行性^[8][10]。确定这些制备条件之后严格遵照既定的实验方法步骤和步骤制备纳米球体，然后测试粒径在通过微调相关实验步骤以及操作中的问题制备出粒径范围在200nm以下的纳米球体冻干得到冻干样成品，后将成品进行扫描电镜观测等系列表征以进一步观测纳米球的相关性状信息。在完成上述系列操作之后下一阶段即是准备进行载药实验测试完成载药率和包封率计算和释药实验数据的收集测试和记录用以来分析试验方法载药能力以及载药纳米球的释药机制是否能够达到实验预期的效果，能否为聚多巴胺载药纳米球作为肿瘤治疗药物的研究提供相关实验数据和现象支持^[8-10]。在表征阶段设计完成一组关于聚多巴胺优良性质的光热敏感特性的光热对比试验，用以佐证聚多巴胺的性

质中关于具有一定光热效应能够成为治疗肿瘤疾病手段中光动力治疗（PDT）的辅助联合应用材料增强肿瘤治疗的疗效^[8-20]。提高治疗效率并缩短治疗时间为患者减轻生理以及心理的负担。

1.2 相关材料简介

1.2.1 pH响应及材料介绍

pH响应型也可以叫作pH依赖以及pH刺激，在药物应用形式中是一种药物和机体（或者机体内部目标治疗部位）之间进行连接并能够产生相互作用的刺激形式，当然刺激形式有多种常见的就是pH刺激、热刺激、光刺激、化学反应刺激（氧化还原效应）、生物分子刺激等^[12]。但就目前研究而言针对恶性肿瘤酸性微环境而人体正常组织大环境呈现生理微碱特性的显著区别，pH响应型生物刺激是保证智能靶向释药的首要选择，本课题中只涉及到pH刺激响应研究引用，既然是pH响应型刺激，那么顾名思义应用环境就要有符合刺激产生的pH稳定或变化环境来作为触发刺激的导火索，其该项特殊性能也恰恰与正常人体在患病之后机体内部有pH环境的变化相符合，就以恶性肿瘤患者的体内微环境分析为例，正常人体除了胃内由于消化需要分泌大量胃酸而呈酸性以外，呈现微碱性质，但是当恶性肿瘤发生于人体机体内部，绝大部分肿瘤病灶部位会有肿瘤细胞过度表达的受体其往往能够创造与pH响应材料引起反应配合的pH条件，该特点也就奠定了pH响应型刺激更容易在药物修饰开发研究中得到应用^[8]。

1.2.2 聚多巴胺（polydopamine，PDA）

聚多巴胺（polydopamine，PDA）是由其单体多巴胺（dopamine，DA）自动氧化聚合产生的，多巴胺聚合机理如图1.1。

图1.1 DA→PDA聚合机理

聚多巴胺具有突出诸多性能的可以和药物传递成像、肿瘤化疗以及其他疾病诊断方法结合增强效用的用于药物包载传递的特殊材料，相较于其他的载药材料，聚多巴胺的研究是基于它在各方面所具有的的突出性能，主要以下几方面：

第一，聚多巴胺在各种基质表面都有强附着性，是以其能够有效的发挥作为包载材料和被包载药物之间的高效粘附，从一定角度上是其作为包载材料能够用较为便捷方式制备出载药纳米球的主要原因之一，包载药物制成载药纳米球作为药用剂型应用时能够促进药物与目标材料或靶体细胞的粘附作用，方便于不同药物或者药物与细胞之间的连接进而发挥相应作用。

第二，聚多巴胺的表面改性赋予聚多巴胺在应用时有较大的表面修饰空间，可以通过添加表面聚合层使得其能够和对应配体共同促使聚多巴胺纳米聚合物表面的功能化用于与目标功能用途相适应。

第三，由于多巴胺作为机体内常见的生物活性分子，而聚多巴胺是多巴胺的聚合产物那么自然而然也就赋予了聚多巴胺良好的生物相容性，由于这一特性使得其能够在应用于生物机体治疗时不会带来生物排斥的新问题，进而能够有效提高其继续加载功能因子的作用在药物在机体内应用时作为良好的包裹材料在药物药效发挥中起到“叩门砖”作用。

第四，①聚多巴胺本身对pH有较高的敏感性，也就是说聚多巴胺本身就是pH响应型材料，不需要另外选取pH依赖性的材料加以包载可以直接得以运用，简便了制备步骤提高了制备的效率以及目标载药纳米球的成功率；②聚多巴胺在体内和体外均无表现出明显毒性，就肿瘤部位治疗来看，聚多巴胺包载着药物达到肿瘤病灶部位，在该酸性条件之下聚多巴胺会自行降解从而使包载在其中的药物得到释放并发挥药效，在药物传递过程中对非靶组织无伤害；③载药材料聚多巴胺的良好生物相容性和pH敏感性使其在非病灶部位基本不会或者很少降解减少了一次伤害程度，而且在病灶的酸性条件之下分解之后的产物并不会给机体造成二次伤害并且不会对机体的代谢产生负担。

第五，聚多巴胺具有良好的水溶性，作为药物的包载材料运用至机体，其良好的水溶性为药物在机体内组织中相互传递的畅通性提供了良好条件。

第六，聚多巴胺拥有高效光热转换特性以及与特殊离子结合比如铁离子能够表现出光热协同治疗引导作用，该项特性针对于癌症肿瘤的治疗手段中可以得到综合的运用，因为就我们现在治疗肿瘤的手段中有光热疗法以及光动力疗法，基于靶向药物在辅助以光敏热敏疗法能够更高效的发挥治疗作用，或许能够缩短治疗周期，减少给药剂量、提高治疗效果。

1.2.3 二氢卟吩e6

二氢卟吩（Chlorin e6，Ce6）是一种不溶于水的光敏剂（结构如图1.2），像其他常用的光敏剂一样具有能够通过近红外NIR光活化效应从而快速的从体内消除同时产生大量的单线态氧从而达到诱导癌细胞凋亡、坏死或者其他针对癌细胞的免疫机制反应从而被应用于肿瘤癌症的光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）。然而与很多光敏剂的性能相同的是Ce6同样有以下不利于其临床应用的几大特点，首先第一点就是其不溶于水导致其在应用时生物相容性比较差，应用效率较低；其次是Ce6容易团聚这就导致分散性比较差进而造成的后果就是不容易快速有效的分散达到有效的治疗目的，通过加大剂量解决会导致大量不必要的损耗；最后一点便是，Ce6是没有生物体内靶向性质的，导致其在应用时无法在靶组织即肿瘤部位产生累计效应从而导致光动力诱导针对于肿瘤的治疗缺乏针对性靶向性，在配合光进行治疗时会导致副作用的产生对患者正常身体机能有较大的损坏。因此在Ce6的应用中应当着手于改造使之成为对人体无毒生物相容性好同时具有肿瘤靶向性的复合药物来以应用于肿瘤光动力联合治疗^[27-29]。

图1.2 二氢卟吩e6

1.2.4 载药纳米球

载药纳米球体包含目标药物和载药材料两大类组成部分，载药纳米球体即由载药材料包裹着目标药物形成的粒径在纳米级别的微小球体，一般载药纳米球的结构是“核-壳”结构，也就是载药材料在目标药物外部完全包裹形成一个球体，而球体内部核心是药物以及其他的治疗辅助的功能性材料，该种纳米球体核-壳结构实质上是纳米药物剂型表面修饰的一种，该类应用药物即是用具有生物相容性良好，具有生物特征敏感性以及能够表现出靶向功能特性等特点的载药材料将药物包载保护起来，赋予药物靶向以及生物敏感特征，使其能在应用时能够在目标部位定点释放避免药物传递过程的药物损失以及传递过程中对机体破坏性，当然在壳体内部药物可以和载药材料进行混合，这样的“核-壳”结构可以更大程度上达到缓控释的目的^[1]。

第2章 Ce6@PDA的制备

2.1 实验阶段安排

本论文就以具有pH相应型聚多巴胺纳米球为主要研究主题展开以下几部分工作：

第一阶段：探究用沉淀法制备聚多巴胺纳米球的最佳条件包括pH；PLGA、蒸馏水和丙酮的比例；避光反应所需要的时间的确定，后以最优条件制备聚多巴胺纳米球测试其粒径并用透射电镜（TEM）观测纳米球的形貌状态。检测聚多巴胺是否能够成功附着在PLGA的表面形成较为均匀的纳米球体。在完成聚多巴胺作为包载材料用于制备纳米球体实验以及相关制备条件载药释药行为确认之后，通过近红外光的光热效应实验来证明聚多巴胺作为纳米球体表面包载材料能否按照预期设想能够辅助于光热效应治疗肿瘤疾病^[11]。

第二阶段：Ce6@PDA纳米球的载药实验测试来检测按照本课题所预设的实验方法制备的Ce6@PDA纳米球的载药量以及包封率。

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