摘 要

目的 建立脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)诱导的慢性帕金森病的小鼠模型，并探讨这种帕金森病的小鼠模型的产生机制。 方法 将24只C57BL/6 小鼠随机分为模型组（8只）、实验组（8只）和对照组（8只），模型组腹腔注射LPS(0．5mg/ml)一次，实验组腹腔注射MCC950（0.5mg/ml），一个小时后腹腔注射LPS（0.5mg/kg）一次，对照组腹腔注射相同量的生理盐水。5周后用旷场实验、转棒实验、抓力实验和跑步机实验评价小鼠的行为学能力。 结果 在旷场实验中，模型组8只小鼠（100%）均不同程度的出现运动距离和运动速度的下降，实验组小鼠与对照组小鼠无明显变化。在转棒实验中，模型组8只小鼠 (100%)在转棒实验中在棒时间显著缩短，难以在匀速转动的棒上长时间坚持，而实验组小鼠与对照组小鼠的数据结果未出现异常。在抓力实验中，模型组8只小鼠中，有7只小鼠（87.5%）出现抓力下降的现象，而实验组中仅有一只小鼠出现抓力下降的现象，对照组未出现异常现象。在跑步台实验中，8只模型组小鼠均同时伴有运动迟缓，肌肉强直，活动量减少等症状，而实验组与对照组中的8只小鼠未出现明显的运动障碍症状，小鼠在行为学实验中各项数据均正常。 结论 在LPS腹腔注射建立的小鼠模型中,模型组小鼠的各项行为学测试结果均出现的不同程度的异常。这表明模型组小鼠在腹腔注射后，其运动能力和反应能力受到了一定程度的损伤，但实验时间过短，并未对小鼠进行长期观察，一些病症未完全表现出来，不能完全确定模型组小鼠是否患上帕金森，因此还需要进行深入的实验，用更多实验结果来验证结果的准确性。对于实验组小鼠，在MCC950的作用下，小鼠并未出现异常，各项测试数据与对照组无差别，说明小鼠未出现运动障碍，在这5周内MCC950保护了小鼠不受LPS的影响。本次实验为帕金森发病机制的提供了方向，行为学实验也为帕金森的动物模型评价提供了新的实验依据。

[关键词] 脂多糖；MCC950；帕金森；小鼠模型；行为学测试

Abstract

Objective A model of chronic mouse Parkinson’s disease induced by Lipopolysaccharide(LPS) was established. Method Twenty four C57BL/6 mice were divided into three groups：model group(8 mice),experimental group(8 mice) and control group(8 mice). The model group received intraperitoneal injection of LPS(0.5mg/kg) once;while the experimental group was injected intraperitoneally using MCC950(0.5mg/kg), and LPS(0.5mg/kg) an hour later; For the control group the same amout of saline was delivered. Five weeks later, four behavioral paradigms were used to evaluate the locomotory ability of mice. Result In the open field experiment,in the model group showed a decrease in the distance and speed of movement. There was no significant difference between the experimental group and the control group.In the experiment,the model group were significantly shortened in the rotating rod experiment,and it was difficult to adhere to the rotating rod at a uniform speed for a long time.There was no abnormality in the data of the experimental group and the control group. In the grip experiment, 7 (87.5%) of the 8 mice in the model group showed a decrease while only one mouse in the experimental group showed normality in the grip,and no abnormal phenomenon was found in the control group. In the treadmill experiment,the model group were accompanied by motor retardation, muscle stiffness and decreased activity, while the experimental group had no motor. Conclusion The mice model was established by intraperitoneal injection of LPS. One month after the injection, model mice showed motor impairments, but in the presence of MCC950, these deficits were rescued.However, the experimental time is too short, some symptoms of PD are not fully manifested, and we can not conclude that PD model mice was established successfully. Further examinations are required to confirm the result in 3 months and 6 months after the injection. In addition, other techniques are also used including Tamp;H staining and ELISA.This experiment provides a direction for further research on the pathogenesis of Parkinson's disease. Behavioral experiments also provide a new experimental basis for the evaluation of Parkinson's animal model.

[Key words] LPS;Parkinson;Mouse model;Behavioral test.

目录

第一章 绪论 1

第二章 正文 5

1 材料和方法 5

1.1 实验动物和材料 5

1.2 模型制作 5

1.3 行为学检测 5

2 结果 6

2.1 一般观察 6

2.2 行为学评估 6

第三章 结论 9

参考文献 12

致谢 14

第一章 绪论

帕金森病是一种慢性、进行性中枢神经系统退行性疾病，大部分发生于高龄人群，主要病症包括肌肉强直、面部呆滞、静止性震颤、运动迟缓、步态异常等运动性症状以及便秘、失眠、抑郁等非运动性症状，病情会随着时间的推移而渐渐加重，逐渐出现语言功能障碍、运动功能丧失、吞咽困难的现象，患者大多生活无法自理，长期卧病在床，极大的影响了生活的质量^[1]。随着我国社会老龄化的加剧，帕金森病的发生日益增多，逐渐成为现今严重威胁我国人民的重病之一。PD的发病机制未能完全阐明，其主要是因为黑质区病变，多巴胺的合成减少，导致纹状体内的多巴胺含量降低。目前临床上主要是用左旋多巴（L-DOPA）代替治疗，尽管该药物可以缓解大量症状，但却不能阻止黑质区多巴胺能神经元功能的丧失与衰落，长期使用还有可能产生更严重的病发症。

最近的研究表明，PD的发病机制可能涉及到多个因素，包括接触环境中的神经毒素(如农药，重金属)、遗传学、和氧化应激。许多实验证实在PD患者和PD动物模型中,黑质除了多巴胺神经功能减弱外，还存在不同程度小胶质细胞和轻至中度星形胶质细胞的激活，由此表明胶质细胞可能参与了PD的发病过程^[2]。而随着人们深入研究PD的发病原因，发现炎症与神经退行性疾病(如帕金森氏病)的进展性质有关，但其机制尚不清楚。

近期大量的研究结果表明，大脑的炎症反应与脑内的一种名为小胶质细胞的活动有关，小胶质细胞是大脑中的固有免疫细胞，是中枢神经系统中特有的细胞种类，它可以积极地监测大脑内的环境，并对多种细胞毒素因子迅速做出反应，在大脑中激活，产生炎性物质，如超氧物、一氧化氮和肿瘤坏死因子-α，虽然小胶质细胞激活对宿主集体的防御起着相当必要且关键的作用，但小胶质细胞的过度激活会产生神经毒性作用，小胶质细胞被激活后会释放大量的细胞炎性因子和氧自由基，导致大脑内部出现神经炎症反应以及过氧化损伤，引起大脑黑质区多巴胺能神经元损伤，最终产生帕金森^[3]。在静息状态下，小胶质细胞是“岔状型”存在，没有吞噬功能，在一些刺激激活后，它的形态与功能发生了改变，转变为“阿米巴状”（Amoeboid），并且成为具有吞噬功能的活化型小胶质细胞^[4]。炎症反应、外伤、退行性病变等均可激活小胶质细胞，过度活化的小胶质细胞将释放大量的细胞炎性因子、氧自由基（如细胞内活性氧类物质或超氧化物等）以及白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干扰素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）等物质损伤神经元^[5]。此外，受损的神经元可能发出损伤信号并引起更多的小胶质细胞的激活，这种小胶质细胞与神经元的相互作用将得到加强并转化为神经元损伤和小胶质细胞激活的自我放大循环，最终导致更多的神经元损伤和死亡。经研究表明，小胶质细胞的活化已经成为大脑内神经炎症反应发生的标志，在LPS脑内注射诱导的PD大鼠模型中，中脑黑质区多巴胺能神经细胞损伤的同时明显伴有者小胶质细胞的激活。在帕金森患者的尸检报告中发现，多巴胺能神经元功能缺失的同时也伴有明显的小胶质细胞的炎症反应，还检测出了大量的TNF-α、IL-1β等炎性物质。因此以小胶质细胞为靶点，炎症反应为突破口的PD治疗方法是如今重要的研究方向之一。

细菌内毒素脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)为革兰氏阴性细菌细胞壁的重要组成部分，是一种强力的致炎因子，可诱导一系列的炎症反应，作为小胶质细胞的一种强有力的刺激因子，已被用于研究帕金森病(PD)发病机制中的炎症过程，以及抗炎治疗对帕金森病(PD)的治疗作用^[6]。在大鼠黑质区注射LPS后，研究者发现LPS诱导小胶质细胞激活和黑质多巴胺能神经元丢失并在随后的一项研究中，发现LPS诱导的多巴胺能神经元损伤是永久性的。此外，注射LPS后，纹状体和黑质的GABA能神经元或5-羟色胺能神经元均未见明显损伤，这表明LPS选择性诱导黑质纹状体多巴胺能神经元死亡^[7]。一例报道表明，一位22岁的实验室工作人员伤口意外接触到了10微克明尼苏达沙门氏菌脂多糖后，发展成帕金森综合症，并伴有运动迟缓、僵硬和震颤；事发几年后，检测发现黑质和大脑皮层受损^[3]。因此，需要大量的实验和研究证实内毒素、炎症反应和PD之间的关系。目前对PD病因和生理病理机制的研究，主要运用PD的动物模型，因此建立一个能表明PD的发病机制和病理学动物模型，是一个重要的研究方法。

近年来PD动物模型的研究发展及其迅速，国内外学者采用1-甲基-4-苯基1,2,3,6-四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine，MPTP）、6-羟基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）等来建立模型，但是这些模型在探究PD发病过程与机制中仍存在较大的局限性^[1]。研究PD的发病机制并寻找相对应有效的治疗方法一直是科学家们所努力的方向。在许多试验中，研究员将LPS直接注入小鼠的黑质纹状体内，引起黑质区多巴胺能神经元损伤，出现PD类症状，但由于该实验将LPS直接注射入大脑黑质区内，并不能很好地说明LPS是对黑质区神经元特异性的产生损伤作用，并且脑内注射不能排除注射时机械损伤产生的后果^[8]。另外，我们在日常生活中很少有大脑直接接触刺激性物质的情况，大多数刺激源是通过胃部或者体液直接进入人体内的。因此本此实验采取了腹腔注射LPS诱导小鼠建立PD模型，通过实验前后小鼠的行为学测试来评估模型是否建立成功，以为PD发病机制和治疗提供理论基础。

根据目前的研究表明，单次腹膜注射LPS导致外周产生肿瘤坏死因子α，而肝脏中的巨噬细胞样细胞是产生肿瘤坏死因子α的主要来源。这些细胞因子被释放到血液中，并在诱发全身性炎症。此外，对其脑切片的免疫组织化学分析显示，在多个脑区中，如海马区和皮质区，均出现小胶质细胞被激活的情况^[9]。而在正常情况下，腹腔注射时，仅有非常少量的LPS能通过血脑屏障。所以，为了了解慢性神经炎症是如何从外周转移到大脑的，科学家们在外周注射了肿瘤坏死因子α，并发现全身性肿瘤坏死因子α和脂多糖(LPS)均能增加脑内促炎症因子如TNF-α、IL-1β、NF-κB-p65的表达^[10]。另一方面，研究表明，肿瘤坏死因子α可被转运到大脑中，并对在外周、血脑屏障和脑内中转运肿瘤坏死因子α蛋白起着很重要的作用。为探讨系统性肿瘤坏死因子α对脑组织炎症反应的作用，有实验设计了单剂量注射LPS(5mg/kg)或肿瘤坏死因子α(0.25mg/kg)对缺乏TNF 1型和2型受体(TNFR-KO)的雄性小鼠进行腹腔注射，肿瘤坏死因子α表达(脑、肝、血清)及其对其他促炎的调节作用检测脑组织中IL-1β、NF-κB和MCP-1基因，实验发现小鼠并没有发生类似于LPS腹腔注射健康小鼠引起的炎症反应，小鼠也没有神经退行性疾病症状的产生^[11]。因此，肿瘤坏死因子α在中枢神经系统对外周免疫反应中的作用是至关重要的。

帕金森最明显的症状是它引起的运动损伤，因此本次实验主要运用四种行为学测试手段来评价小鼠模型建立的程度，这四种行为学测试分别为：旷场实验、转棒试验、抓力实验和跑步台实验。旷场实验（Open field test），又名敞箱实验，是用来评价动物在陌生环境中的自主行为、紧张程度与探索行为的一种方法。以小鼠的路径、行进距离、平均速度和在中心区域的时间来反映小鼠的紧张程度和探索行为。转棒试验用于检测实验动物大脑反应速度和四肢协调能力。以小鼠在匀速转动的转棒仪上停留时间来表示其运动协调能力。转棒仪由履带带动棒旋转，底部设置有灵敏传感器，以记录小鼠掉落时的时间，棒上设置有5个隔盘，可同时测量6只小鼠。抓力实验是利用仪器对大、小鼠抓力进行测试，来评价药物、毒物、肌肉松弛剂、兴奋剂、中枢神经抑制剂等对动物肢体力量的影响程度，同时也可以对动物的衰老、神经损伤、骨骼损伤、肌肉损伤、韧带损伤程度及其恢复程度进行检测、这是一项适用范围很广的实验项目。由于该实验使用仪器操作简单，使用方便、指标明确，特异性强而广泛运用于国内外科研工作者的研究中，也收到了很好的实验效果。动物跑步机主要是用于鼠类动物跑步运动测试，可去对待传统的游泳训练测试，使训练强度指标更加准确，是动物体能、耐力、运动损伤、营养、药物、生理和病理研究等试验中必要的研究手段之一。经过行为学的测试结果，我们可以判断模型小鼠是否有行为学方面的缺陷，是否存在运动障碍，从而判断LPS与MCC950是否对小鼠起到了影响。

MCC950是一种高选择性炎性小体NOD样受体蛋白3(NOD样受体蛋白3，NLRP3 )的抑制剂，可以特异性地抑制NLRP3 的激活。作为固有免疫的重要组成部分, NLRP3炎性小体在人体的疾病产生发展以及相应机体免疫反应过程中发挥着重要的作用。在小胶质细胞总存在一种多效性的细胞核转录因子NF-κB，该因子能够控制调节许多炎症因子的因袭传导，其中有一条十分重要的炎症信号传导通路叫NF-κB-NLRP3炎症体-1-IL-1β。该核转录因子在被激活后会进入细胞核内，首先将促进IL-1β基因的表达，产生大量没有活性的白介素-1β前体物质，其次它还会促进NLRP3的表达。NLRP3在接收到刺激之后，与有关蛋白质结合，组成了NLRP3炎症体，该炎症体又对白介素前体物质进行剪切，生成具有剧烈活性的白介素-1β，之后再参与其他重要的炎症因子的合成，趋化因子的转化，循环式的放大大脑中的炎症反应^[12]。目前的研究表明，NLRP3炎症体的表达能够有效地缓解神经炎症反应和神经退行性疾病，改善认知功能。在人体内，NLRP3可被许多刺激源和内环境改变等信号激活，在炎症反应中发挥核心作用，因此，NLRP3可作为与炎症反应相关疾病的突破方向，那么MCC950作为NLRP3的特异性抑制剂，就有者重要的研究价值。根据文献记载，MCC950能够抑制IL-1β的产生，再而缓和自身免疫疾病的严重程度，也能缓解脑出血后脑部损伤的后果。相关研究发现，由于神经胶质细胞引发的炎症反应在中枢神经系统中能够对神经细胞产生损伤，而长时间的炎症反应持续刺激下，胶质细胞引发的炎症反应被循环放大，进而引发各种神经性疾病，MCC950则在其中能够保护神经元，发挥预防与保护的功能^[13]。本次实验设计了实验组，先注射MCC950后再注射LPS，对比模型组观察MCC950对炎症的抑制与帕金森样症状之间的关系，进一步验证炎症反应在帕金森发病原因中的贡献作用以及MCC950的保护作用是否对帕金森的治疗产生效果。

第二章 正文