摘 要

聚合酶II多肽E（POLR2E）中的rs3787016多态性先前被鉴定为与前列腺癌、食道癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺乳头状癌和甲状腺癌的风险相关，表明了rs3787016位点可能作为影响个体癌症易感性的常见遗传因素。为了证明这一相关性，我们进行了病例对照研究，以探讨rs3787016和宫颈癌与乳腺癌之间的关联风险，并确认了rs3787016与中国湖北人口乳腺癌之间的关联，随后进行荟萃分析，以精确估计rs3787016和女性乳腺癌和宫颈癌之间的关联的风险。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) 进行基因分型，测序证实。我们的结果表明rs3787016与乳腺癌和宫颈癌的风险相关，并且分层分析表明，这种关联仍然特别适用于≤60岁的吸烟和饮酒的女性。总的来说，POLR2E rs3787016多态性可能是女性乳腺癌和宫颈癌易感性的有价值的生物标志物。

关键词：SNP 乳腺癌 宫颈癌 rs3787016 POLR2E

Abstract

The rs3787016 polymorphism in polymerase II polypeptide E (POLR2E) was previously identified as associated with prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, breast cancer, papillary thyroid carcinoma, and thyroid cancer, suggesting that rs3787016 may act as an affected individual. Common genetic factors for cancer susceptibility. To demonstrate this correlation, we conducted a case-control study to investigate the association risk between rs3787016 and cervical cancer and breast cancer, and confirmed the association between rs3787016 and breast cancer in Hubei, China, followed by a meta-analysis to Accurately estimate the risk of association between rs3787016 and female breast and cervical cancer. PCR-RFLP was used for genotyping and sequencing. Our results indicate that rs3787016 is associated with breast cancer and cervical cancer risk, and stratified analysis suggests that this association is still particularly applicable to women who smoke and drink alcohol at age 60. In general, the POLR2E rs3787016 polymorphism may be a valuable biomarker for breast and cervical cancer susceptibility in women.

Key Words：SNP Breast cancer Cervical cancer rs3787016 POLR2E

目录

第1章 绪论 1

1.1 乳腺癌和宫颈癌现状 1

1.2 乳腺癌和宫颈癌的遗传机理研究 2

1.3 POLR2E基因中的rs3787016位点 3

1.4 SNP（单核苷酸多态性）与rs3787016位点 4

第2章 材料和方法 6

2.1 实验器材 6

2.2 实验试剂 6

2.3 采集样本 6

2.4 样本的处理 7

2.4.1 样本DNA的提取 7

2.4.2 DNA纯度检测 7

2.5 扩增POLR2E基因的相关序列并使用PCR-RFLP法检测SNP 7

2.5.1 设计酶切错配引物 8

2.5.2 进行PCR反应 8

2.5.3 SNP的酶切结果 8

2.6 凝胶电泳 9

第3章 结果与讨论 10

3.1 POLR2E基因rs3787016位点与乳腺癌及宫颈癌的相关性 10

3.2 POLR2E基因rs3787016位点与女性癌症的相关性 12

3.3 讨论 17

第4章 结论 19

第5章 展望 20

参考文献 22

致谢 24

第1章 绪论

1.1 乳腺癌和宫颈癌现状

乳腺癌和宫颈癌是两种严重恶性肿瘤，在全球范围内的女性都深受其害，需要共同去面对。乳腺癌是影响女性生活品质和身体健康的一个较为常见的癌症，许多科研文献显示，女性在她从出生开始到死亡的生命线中患有乳腺癌的风险高达1/8。例如，在英国2011年被发现患有乳腺癌的女性人数为52250人，其中增长较快的是超过50岁的大龄女性，由此一定程度上可见乳腺癌发病率会随年龄而增长^[1]。在2015年，全世界一共有130万女性被诊断其患有乳腺癌，并有46.5万女性死于这种癌症，与男性相比，女性更容易患有这种疾病。北美和欧盟的乳腺癌死亡率有所下降，这主要是由于早期发现和有效的系统治疗。2016年，欧盟欧盟死亡率下降近8%。尽管如此，乳腺癌在发展中国家仍然是最为常见的癌症致死原因，而在发达国家，如美国和德国、英国、法国等北美或欧洲各国仅次于肺癌。在南美洲、非洲和亚洲，乳腺癌的发病率正在上升—很可能是因为生活方式的改变和筛查项目的启动。这些地区的乳腺癌死亡率也在不断上升，部分原因是缺乏最先进的诊断和治疗手段。

自3500多年前最早的文献记载以来，人类一直在努力理解和治疗乳腺癌。乳腺癌的晚期肿块的触感和可见性，使医生在几乎所有有记载的历史时期都能诊断出晚期乳腺癌。自古以来，尽管乳腺癌具有晚期明显的疾病表现和高死亡率，但是因为文化原因与性内涵有关的乳房疾病被污名化，直到近现代才在公众有限认知的临床杂志和教科书中出现描述^[2]。此外，从古文明时代到18世纪和19世纪，人们都认识到乳腺癌一旦扩散就无法治愈。在许多文化中，乳腺癌仍然被认为是一个禁忌话题。因此许多病人不愿意坦率的谈论他们的疾病或其症状。然而，道德和伦理的变化使得乳腺癌的话题在今天的几乎所有的论坛或者网站上都是公开讨论的话题。此外，随着电子媒体和互联网的出现，在世界上偏远的地区也能有限的认识到这种疾病。我们对乳腺癌的临床认识从公元前460年左右的早期描述为“含黑胆汁的蟹样肿瘤”，到现代的描述为一种异质性疾病，在组织病理学、遗传变异、分子亚型和临床结果方面表现出多样性。此外，近几十年来的科学发现为预防、检测、诊断和治疗乳腺癌带来了新的，更好的方法。

乳腺癌是由乳房中存在的恶性细胞所引起的一种恶性肿瘤。恶性细胞（癌细胞）的特点就是可以无限制的分裂，不受人体机能调控，导致异常生长（原位癌）和具有局部侵袭正常组织的能力（侵袭性癌）。根据乳腺的腺单位或导管单位是否参与，病理学家可以将乳腺癌细分为不同类型。原发性肿瘤开始于乳腺，一旦侵入，可能会发展到局部淋巴结，然后慢慢向身体其他部位扩散，全身最常见的受连累部位是肺、骨、肝脏、皮肤和软组织。肿瘤区域淋巴结的数量是一个非常好的指标用来判断肿瘤是否转移。癌变细胞如果扩散到身体的其它组织器官，就会引起其它组织器官的癌变，导致人体机能一直处于不可控状态，严重影响到女性的身心健康。据统计，从上世纪晚期到现今，全球乳腺癌的发病率就处在一个只增不减的现状中，21世纪的今天，乳腺癌更是成为了一个影响到全球女性健康的严重疾病。女性乳腺恶性肿瘤的成因目前还没有完全了解清楚，然而女性的乳腺癌发病是可以找到一些规律的，根据一些科学家系统的研究，如果她们女性携带有乳腺癌的危险因素，就会比一般的女性有更高的概率患有乳腺癌，那么什么是高危险因素，在研究者进行了大量的科学论证和统计学的数据分析之后，得出的一些患乳腺癌女性她们所拥有的一些共性。如：长期有过量饮酒行为；胸部有过强射线照射；月经初潮较早或绝经较迟；携带有与乳腺癌相关的基因位点等等。当然，女性本身具备了上述的一种或多种高危因素并不代表着此女性一定患有或会患有乳腺癌，只是说她会有比正常女性更高的患病风险。

子宫颈癌也是全球常见的影响女性生活健康的恶性肿瘤，同乳腺癌一样是一个比较严重的的全世界女性所面临的健康挑战。2015年约有27万宫颈癌死亡病例，而其中高达九成的病例发生在落后国家或地区和发展中国家，这些国家死亡率是发达国家的18倍^[3]。几乎所有的宫颈癌都是由人类乳头状瘤病毒（HPV）的两种高危亚型导致的。尽管在过去的十年中，预防、筛查、诊断和治疗取得了很大的进展，但宫颈癌问题仍不容忽视。在2018年，有约57万被确诊为宫颈癌的病例，全球有31万余人死于这种恶性肿瘤。在高收入国家，自从正式开始筛查计划以来，宫颈癌发病率和死亡率在过去30年里下降了一半以上。而在资源较低的环境中，发病率有所上升或保持稳定。在已经实施接种HPV疫苗接种计划的国家，预计宫颈癌的发病率会有明显下降，但是由于存在潜伏期，这种下降在最近数年内都不会很明显。在早期阶段，宫颈癌通常症状并不明显，需通过筛查或者盆腔检查来发现。一般症状有性交后阴道异常出血、阴道分泌大量恶臭分泌物等。有宫颈癌症状的女性需要盆腔检查、宫颈和阴道粘膜的显像以及宫颈细胞学检查。宫颈癌可以通过淋巴管转移到身体其他组织器官，如盆腔和腹股沟淋巴结等。在疾病的晚期，腹股沟和锁骨上淋巴结肿大硬化。

1.2 乳腺癌和宫颈癌的遗传机理研究

人是否会患乳腺癌或其患乳腺癌的风险高低目前来看是很有可能受遗传因素的影响，此前所发现的一百多个基因区域与乳腺癌风险有一定的关联，但是它们如何调控或影响乳腺癌的发病风险还是不完全清楚。在2017年的10月下旬，《自然》和《自然-遗传学》期刊同期发表了两篇论文，介绍了增加乳腺癌患病风险的相关遗传因素，这将有利于改进乳腺癌的早期筛选和检测方法，并可能为新药物的研发提供思路。据悉，科学家分析了275000名女性的遗传数据，其中146000人被诊断患有乳腺癌。第一项研究在线发表于《自然》期刊，题为“Association analysis identifies 65 new breast cancer risk loci”。文章报道了一项全基因组关联性分析（GWAS）的研究结果，研究人员对122977名欧洲乳腺癌患者和105974名对照者进行了基因分型阵列和SNP分析，在已知和新的风险位点之间发现了潜在联系。同时，他们对14068名东亚乳腺癌患者和13104位无乳腺癌东亚人进行了基因数据分析，证实了许多以前认为与乳腺癌相关的基因位点，同时确定了65个新的基因位点与乳腺癌有显著关联。这项研究能够解释一部分的家族性乳腺癌患病风险。第二项研究与第一项研究同一天发表在《自然-遗传学》期刊，题目为“Identification of ten variants associated with risk of estrogen-receptor-negative breast cancer”。相关科研人员研究了一种乳腺癌亚型—雌激素受体阴性乳腺癌有特殊联系的变异体。该研究同样由Easton和来自英国、美国、加拿大以及荷兰的研究人员共同完成。研究人员利用GWAS比对分析人群基因组，包括2万多位这种乳腺癌亚型的患者，1.8万多名BRCA1基因突变携带者（9400多位乳腺癌患者），大约10万名健康对照者，研究了单核苷酸多态性和雌激素受体阴性乳腺癌风险的关联性。他们的遗传变异风险研究为以前在雌激素受体阴性乳腺癌病例中或BRCA1突变携带者中发现的11个SNPs中的10个新风险位点提供了证明，同时也发现了9个不相关位点，包括细胞周期基因CCNE1及周围的10个变异、编码钙黏蛋白的CDH2基因等。

1.3 POLR2E基因中的rs3787016位点

POLR2E基因，该基因编码RNA聚合酶II的第五大亚基，该聚合酶II负责合成真核生物中的信使RNA。该亚基由另外两种DNA指导的RNA聚合酶共有，并且以相对于其他聚合酶亚基的两倍摩尔过量存在。细胞遗传学位置：19p13.3 基因组坐标（GRCh38）：19：1,086,578-1,095,391（来自NCBI）

研究发现新的遗传位点对于乳腺癌的易感基因变异标记提供帮助，对于改进早期乳腺癌的筛选和检测有好处，也能够对新药物的开发研制提供想法。聚合酶II多肽E(POLR2E)中的rs3787016位点多态性先前被鉴定为与前列腺癌、食管癌、乳腺癌、甲状腺乳头状癌和肝癌的风险相关，表明rs3787016位点可能是影响个体癌症易感性的共同遗传因素。由于地域的差异，不同地域的女性可能对某个基因的表达及敏感性不同。此前还未有人对湖北地区女性做相关基因位点的研究。此次课题我们拟将以湖北地区女性为研究对象开展一项病例对照研究，以探讨rs3787016位点与湖北女性人群乳腺癌和宫颈癌发生的相关性。

rs3787016位点可能与中国湖北地区女性乳腺癌和宫颈癌的易感性息息相关，为了证明这一设想，我将以湖北地区女性为主体，进行大量的采样调差研究，以患者组与正常组作为互相对照。通过实验结果以及荟萃分析来阐述rs3787016位点与女性人群患乳腺癌和宫颈癌的相关风险性，而我们的实验结果表明了rs3787016位点与女性患乳腺癌和宫颈癌的风险具有相关性，由此可见，POLR2E中的rs3787016位点单核苷酸多态性极有可能是检测女性乳腺癌和宫颈癌易感性的重要生物标志物。

1.4 SNP（单核苷酸多态性）与rs3787016位点

单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上的单个核苷酸变异，属于可遗传变异，而且也是非常普通的常见的一种变异，一般来说包括转换、颠换、缺失、插入四种^[4]。由于其丰富的多态性，第三代遗传标志就是SNP，它是一个非常重要并且实用的工具，用于鉴定检测疾病的相关基因，发现高危人群。SNPs标记是新一代的遗传标记技术，相比于之前的限制性片段长度多态性标记，微卫星标记还有基因遗传标记，SNPs被认为是癌症易感性和药物反应的决定性标记。目前在人类基因组的研究中，SNPs已经成为一个重要的部分^[5][6]。最常见的SNPs多态性是二等位多态性，有四种不同的类型，包括一种转换C—T(G—A)和三种颠换C—A(G—T)、C—G(G—C)、T—A(A—T)，其中为C—T(G—A)在人类中的发生频率最高，占三分之二。

近几年来，已经有许多文献报道采取多种检测方法研究基因的单核苷酸多态性与各种癌症之间的相关性。如DNA测序、单链构象多态性分析（SSCP）、变性高效液相色谱（HPLC）与凝胶电泳、限制性片段长度多态性分析、杂交分析等，这些方法都有其自身的优缺点。

PCR-RFLP方法

RFLP意为限制性片段长度多态性，是一种经典的检测方法^[7]。这种方法是运用酶切位点进行酶切，产生不同长度的基因片段后，运用凝胶电泳将不同长度的条带电泳到不同位置，然后通过条带的条数来分析位点的基因序列。因此这种方法测定的序列是必须要能被特定酶切开的序列。

SSCP 方法

此方法是通过DNA的密度不同，在电泳过程中的移动速度也不同来判断片段是否有突变。不需要很精密的仪器，但是他的灵敏度也因此较低，一般不会单独使用。

基因芯片技术

基因芯片受益于计算机芯片，在其启发下将DNA探针与半导体技术相结合，可以将DNA的序列集成到一块小小的硅基芯片上，用于基因序列的检测。此种方法能一次检测大量的序列，而且准确迅速。

DNA测序

DNA测序是对DNA分子一级结构的分析，通过提供各种DNA合成所需的原材料，让其按照碱基配对规则进行DNA的合成。目前DNA测序方法主要有终止法、自动化测序、化学降解、基因芯片等方法。如果健康人群接受基因测序测出多个突变位点的话，能够有意识地通过改变饮食和生活方式来预防癌症的发生。这样的一种“先知”能让很多人可一远离病魔的折磨。例如食管癌跟日常亚硝酸盐摄入过度有关，日常应该有意识少吃腌制食物，这样的话可以降低发病风险。此外，选择基因检测方法对避免肺癌病人过度用药、提高患者生活质量、以及改善预后有非常重要的意义。因为很多化疗的药物会对人体器脏产生副作用，采用靶向药物治疗可以帮助降低药物副作用以及减轻患者经济负担，切实能起到一举两得的作用。

目前，许多研究已经表明人体基因的单核苷酸多态性与恶性肿瘤发病具有相关性。而SNP基因型的分布存在种族和地区间的差异，由此产生不同地区对肿瘤的差异易感性。rs3787016位点单核苷酸多态性位于RNA聚合酶II多肽E的第四内含子基因中（POLR2E），编码RNA聚合酶II亚基，负责合成信使RNA。一些后续研究表明POLR2E基因rs3787016位点多态性与易患乳腺癌显着相关，另一方面，我们进一步进行了荟萃分析，以提供rs3787016位点与女性患乳腺癌和宫颈癌风险的关联之间的精确估计。

我们的此次实验研究将会采用PCR-RFLP方法进行基因分型，结合PCR扩增片段，凝胶电泳，DNA测序等方法得出所需的实验数据，然后运用统计学方法分析处理数据，来进行对SNP位点与乳腺癌和宫颈癌发病风险相关性的评估。PCR-RFLP操作并不复杂，也无需大量昂贵仪器，能缩短实验所需时间，但是其结果却是显而易见的，给人非常直观的判断。

第2章 材料和方法

2.1 实验器材

本次毕业设计所需要的各种仪器均由武汉理工大学化生学院生物系实验室提供。

2.2 实验试剂

（1）血液基因组DNA提取试剂盒（生产商：天根生化 官网： www.tiangen.com）（注：需按照试剂盒操作规范进行DNA提取，试剂使用要注意各试剂瓶上标签）。

（2）其他各项试剂包括DNA试剂盒均由武汉理工大学生物系实验室提供。

2.3 采集样本

在本次研究中我们一共在湖北地区招募了一共1364位志愿者，其中有480名患有组织学证实的乳腺癌患者，384例组织学证实的宫颈癌患者，500例正常对照。所有样本都是住在中国湖北省的生物学上不相关的汉族人。目前，因为收入的提高，生活水平的上升，人们意识到健康的重要性，更多的中国人倾向于每年进行体检。正常的对照组是选自在同一时期来自武汉市新洲区人民医院的志愿者，经过定期检查的志愿者均不患有癌症，同时对照组还包括一些自愿参加流行病学检查的人，他们也均不患有癌症。我们要求正常对照组全部通过最近3年的年度体检。从湖北肿瘤医院和武汉市新洲区人民医院招募组织病理学确认了乳腺癌或宫颈癌的患者和志愿者。样本信息见表2.3