摘 要

肝是人体的重要器官，具有代谢毒素和药物的功能，对维持身体正常生理活动具有不可替代的作用。目前的基础研究中，科学家通常利用二维培养的肝癌细胞系为模型来研究肝的代谢功能。越来越多的研究表明，二维培养的细胞在形态、功能以及基因表达谱上与实体组织中的细胞存在很大差别，因此，三维培养对于肝脏乃至其他组织细胞的功能研究具有重要的价值。三维培养可以模拟正常细胞的基质微环境，包括细胞-细胞和细胞-基质间的相互作用关系，因而可以在体外模拟正常组织的生长、增殖、凋亡以及分化等特性，对于组织的代谢功能具有关键意义。HepG2是一种实验中常见的永生化细胞，能模拟原代肝细胞的大部分功能和表型，具有遗传稳定性。

本研究拟利用悬滴法和悬浮法，在体外利用HepG2细胞构建细胞微球（pellets），模拟微型肝癌组织。为了进一步研究肝癌细胞微球的生长状态，本研究将体外形成的细胞微球包埋在聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA）/透明质酸甲基丙烯酸酯（HAMA）复合水凝胶中，通过光交联定型，构建类肝癌组织。之后，在三维状态下培养3-7天， 观察肝癌组织微球的分布情况与存活状态，通过分析相关基因表达及组织学特征，鉴定类肝癌组织的形态和功能。本研究发现：（1）悬滴法细胞微球的大小较悬浮法均匀；（2）在与肿瘤形成相关基因IL-8和MMP2的检测结果中，悬浮法制备的细胞微球比悬滴法微球的基因表达情况高。本研究将为在体外形成更好模拟人体肝癌的类组织微球起到重要的参考作用。

关键词：肝癌细胞HepG2；细胞微球；悬滴法；悬浮法；水凝胶

Abstract

Liver is an important organ of the human body, which can maintain the normal physical activity of the body, with the function of metabolizing toxins and drugs. In the current basic research, scientists usually use two-dimensional culture of liver cancer cell lines as a model to study the metabolic function of the liver. More and more studies have shown that there is a big difference between two-dimensional culture and the body in cells’ morphology, function and gene expression profile . Therefore, three-dimensional culture for the liver and other tissue cells has important value in the functional research. Three-dimensional culture can simulate the matrix microenvironment of normal cells, including cell-cell and cell-matrix interactions. Therefore, three-dimensional culture can simulate the growth, proliferation, apoptosis and differentiation of normal tissues in vitro, which is of great significance to the metabolic function of tissues. HepG2 is an immortalized hepatocellular carcinoma cell line which are the most widely used standardized cell in liver tissue engineering studies.

In this study, HepG2 cells were cultured into pellets by hang-drop method and suspension method, and the micro-hepatocellular carcinoma tissues were simulated in vitro. The growth of the pellets of HepG2 cells was studied. The pellets were suspended in the composite hydrogels of polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) and the methacrylated modified hyaluronic acid (HAMA). The hydrogels were prepared by photocrosslinking. Pellets were cultured in a three-dimensional state for 3-7 days. The results showed that: (1) The size of cell pellets from hang-drop method is more uniform than the pellets from suspension method; (2) In the detection of tumor-forming related genes IL-8 and MMP2, , the genes expression of pellets prepared by suspension method were higher than the pellets from hang-drop method. This experiment plays an important role in forming tissue microspheres that better simulate human liver cancer in vitro.

Key Words: hepatocellular carcinoma cell HepG2; pellets; hang-drop method; suspension method; hydrogel

目录

摘要 I

Abstract II

第1章 绪论 1

第2章 生物材料合成 4

2.1聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）合成 4

2.1.1 实验试剂 4

2.1.2 实验仪器 4

2.1.3 PEGDA合成 5

2.2透明质酸丙烯酸甲酯（HAMA）制备 5

2.2.1实验试剂 5

2.2.2实验仪器 5

2.2.3 HAMA合成 6

第三章 肝癌类组织微球构建 7

3.1 HepG2肝癌细胞培养 7

3.1.1实验试剂 7

3.1.2实验仪器 7

3.1.3 HepG2细胞培养 8

3.1.3.1细胞解冻 8

3.1.3.2消化传代 8

3.1.3.3细胞冻存 8

3.2悬滴法制备微球 8

3.2.1实验试剂 8

3.2.2实验仪器 9

3.2.3细胞微球制备 9

3.3悬浮法制备微球 9

3.3.1实验试剂 9

3.3.2实验仪器 10

3.3.3细胞微球制备 10

3.4光交联构建微球-凝胶结构 10

3.4.1实验试剂 11

3.4.2实验仪器 11

3.4.3光交联构建微球-凝胶结构 11

第四章 肝癌类组织检测与评价 13

4.1组织学检测 13

4.1.1实验试剂 13

4.1.2实验仪器 13

4.1.3 HE染色 14

4.1.3.1水凝胶组织切片 14

4.1.3.2 HE染色 15

4.2基因表达分析 16

4.2.1实验试剂 16

4.2.2实验仪器 16

4.2.3 RNA提取 16

4.2.4 RNA逆转录 17

4.2.5 RT-PCR 17

第五章 结果与讨论 19

5.1微球形态学表征 19

5.2染色分析 20

5.3基因表达分析 22

参考文献 24

致谢 27

第1章 绪论

肝是维持身体正常生理活动的重要器官，它具有代谢去除化学物质、毒素和药物的功能。通常，为了研究肝组织的药物代谢过程，一般通过动物模型的体内实验和人类细胞培养模型的体外实验来实现。体内实验由于物种的差异性会有与人体不同的生化反应，所以，我们更倾向于用人类的肝细胞模拟人体肝组织。

二维细胞培养已广泛应用于生物学研究，但并不能精确地模拟生物体内的状态。相比于二维细胞培养，三维细胞培养通过运用再造细胞外基质，能够模拟生物体内细胞的生存环境，为细胞提供一个更加接近其在体内生存条件的微环境，更有利于对细胞的研究。传统的单层细胞培养即二维细胞培养是普遍采用的细胞体外培养手段，并不是细胞生长的自然状态，因而细胞在形态学、信号转导和基因表达等方面都会与天然状态存在差异。三维细胞培养是将细胞与三维载体在体外共培养，使细胞在载体的立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞载体复合物。三维培养体系为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，并建立细胞间及细胞与基质间的联系，形成一定的三维结构。三维细胞培养在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与二维细胞培养均有明显差异，而与体内细胞生长环境更为相似。三维细胞培养既能够保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性。

目前， 国内外基于生物人工肝生物反应器及肝细胞三维培养肝组织构建的研究非常多，根据应用领域及采用技术的不同，有以下几种体外培养方法：①中空纤维生物反应器三维培养；②基于微载体培养的生物反应器三维培养；③球形聚集三维培养；④去细胞肝脏支架三维培养；⑤细胞片层三维培养；⑥静电纺丝三维培养；⑦快速成型三维培养；⑧微流控芯片三维培养。^[1]本研究中所涉及到的体外三维细胞培养技术就是第三种培养细胞微球。利用细胞本身粘附聚集特性，将其分离后，通过抑制细胞贴壁和促进聚集的方法，使细胞聚集，形成多细胞球形体。这个方法可以使细胞逐渐成球成细胞团，而且在这个过程中没有添加外源支架材料。