摘 要

通过分析鬼臼类中药材八角莲、南方山荷叶、桃儿七、小八角莲和利川八角莲的ITS2（internal transcribed spacer 2）条形码序列，探讨鬼臼类药材鉴定新方法。对22份样品提取基因组DNA，PCR扩增ITS2序列并进行双向测序，所得序列经CodonCode Aligner拼接后，采用MEGA5.0软件进行序列对比，计算种内和种间遗传距离（K2P），构建邻接树（neighbor-joing Tree,NJ Tree）。结果表明，无论是鬼臼属的八角莲（利川八角莲经鉴别为八角莲）和小八角莲，还是山荷叶属的南方山荷叶和桃儿七属的桃儿七，ITS2序列种内变异均小于种间变异。ITS2序列长度为247，变异位点达40；NJ树结果显示南方山荷叶、桃儿七、八角莲和小八角莲可明显区分。利川八角莲经BLAST鉴定为八角莲。因此ITS2序列可用于鉴定鬼臼类中药材。

关键词：DNA条形码；物种鉴定；ITS2序列；鬼臼类中药材

Abstract

In order to identify Dysosma versipellis，Diphylleia sinensis，Sinopodophyllum hexandrum，Dysosma difformis and Dysosma lichuanensis using ITS2 barcodes，genomic DNA from 22 samples was extracted and the ITS2 (internal transcribed spacer) regions were amplified and sequenced． The genetic distances were computed using MEGA5．0 in accordance with the kimura 2-parameter (K2P) model and the neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree was constructed．The results indicated that for Dysosma Woodson (Dysosma versipellis、Dysosma difformis and Dysosma lichuanensis)，Diphylleia Michaux(Diphylleia sinensis) and Sinopodophyllum Ying(Sinopodophyllum hexandrum)，the intra-specific variation was smaller than inter-specific one．There are39variable sites among 270 bp after alignment of all ITS2 sequence haplotypes． For each species，the intra-specific genetic distances were also smaller than inter-specific one．Furthermore，the NJ tree strongly supported that，Diphylleia sinensis，Sinopodophyllum hexandrum，Dysosma versipellis and Dysosma difformis can be differentiated.But,Dysosma versipellis and Dysosma difformis can not be distinguished effectively.By the professional web site-BLAST identified，Dysosma lichuanensis belongs to Dysosma versipellis.At the same time，V．souliei (Dolomiaea souliei) and V．souliei var．cinerea( D．souliei var．cinerea) belonging to Vladimiriae Radix were clearly identified．In conclusion，ITS2 barcode could be used to identify Ghost mortar class Chinese medicinal materials.

Key words DNA barcoding; species identification; ITS2; Ghost mortar class Chinese medicinal materials

目 录

第一章 绪论 1

1.1 DNA条形码技术 1

1.1.1 DNA条形码技术研究历程 1

1.1.2 DNA条形码技术的特点及优势 1

1.2 鬼臼类中药材 2

1.2.1 鬼臼类中药材简介 2

1.2.2 国内外研究现状 2

1.3 研究的目的及意义 3

1.4 研究的内容及目标 4

1.4.1 研究内容 4

1.4.2 研究目标 4

第二章 鬼臼类中药材DNA条形码实验研究 5

2.1 实验原理 5

2.1.1 实验的基本原理 5

2.1.2 DNA检测 5

2.1.3 DNA扩增原理 5

2.1.4 测序原理 6

2.2 实验耗材 6

2.2.1 基原植物的采集、保存和鉴定 6

2.2.2 仪器与试剂 7

2.3 实验步骤 6

2.3.1 DNA的提取 10

2.3.2 样品DNA 的保存 11

2.3.3 DNA 纯度检测 12

2.3.4 PCR扩增 12

2.3.5 琼脂糖凝胶电泳检测 13

2.3.6 测序 13

第三章 实验结果分析 15

3.1 鬼臼属药材种内序列特征分析 15

3.2 鬼臼属药材种内序列特征分析 16

3.3 鬼臼类中药材NJ树图分析 17

第四章 结论 18

参考文献 19

致 谢 21

第一章 绪论

1.1 DNA条形码技术

DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，从而实现对物种的快速自动鉴定，并有望实现自动化^[1]。该方法通过筛选大量来自不同科、属甚至是种的样品，确定其中通用条形码，建立条形码数据库和鉴定平台，日后就可以通过生物信息学分析方法分析比对DNA 数据，进而实现对物种快速鉴定。

1.1.1 DNA条形码技术研究历程

加拿大科学家Paul Hebert等人通过对动物界脊椎动物和无脊椎动门 13320个物种进行了分类研究，发现了COI 基因对动物鉴定具有良好的鉴别效果，因此将COI基因作为动物鉴定通用条形码序列，由此率先引入了DNA条形码技术的概念。DNA分子鉴定概念的提出突破了传统鉴定学的认知，对物种鉴定提供了新的突破方向，Gregory认为，对DNA条码的研究将成为一个继人类基因组计划之后的全球性的科学计划^[2-3]。

真菌的DNA条形码是细胞核编码的核糖体大亚基DNA（nrDNA-LSU）和内转录区（ITS）。大部分动物的DNA条形码是线粒体细胞色素C 氧化酶亚基1（Mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1，CO1）的一段长度为648 bp的区段。植物的情况比较复杂，由于植物线粒体的基因含量以及结构变异很大，CO1基因在植物尤其是高等植物中的进化速度比动物要慢得多，因此CO1基因不能用于植物物种鉴定^[3]。所以，为了研究可以鉴定植物的通用序列，经科学家多年研究 ITS、质体 rbcL、matK、ndhF、atpB 以及 trnH-psbA和 trnL-F基因间间隔区序列等可以用于高等植物物种鉴定。目前科学家发现 rbcL (科级) matK (属级) ITS2 和 trnH-psbA (种级) 这种阶元型并可拆卸的条形码组合用于陆地植物的DNA条形码构建比较可行。但是由于这些位点的本身的特点和在植物中的变异均不相同，迄今为止还没有找到合适的序列像动物中CO1作为标准条形码鉴定植物基因的效果^[4-5]。