摘 要

本研究通过使用口腔灌胃的方法给小鼠喂食Cuprizone利用其毒性诱导来建立多发性硬化症老鼠模型，验证这种改进后多发性硬化症老鼠模型的可靠性，从而为新药研究过程中以及疾病病理学研究过程中的动物模型提供一种更有效更节约成本的选择[^[1]]。本实验将小鼠随机分为三组，每组6只。一组每日使用Cuprizone-MC(甲基纤维素)悬液灌胃一次，一组每日使用MC灌胃一次作为安慰剂对照组，最后一组每日用清水进行一次灌胃作为空白对照。实验所用Cuprizone浓度为0.2%，MC浓度为0.1%。同时每天在进行灌胃操作前需进行神经功能评分观察小鼠的症状及其变化。一共进行为期五周的灌胃操作。灌胃结束后对每组老鼠进行行为学测试，包括旷野实验，转棒疲劳仪实验，小鼠抓力测试实验和跑台实验。通过四种行为学实验对实验组和对照组小鼠的行为学差异进行观测从而对灌胃Cuprizone建立多发性硬化症动物模型的可靠性进行验证。而最终的结果也显示差异是确实存在的，通过神经功能评分可以看到实验组小鼠评分普遍偏高且呈现某种发展趋势，旷野实验中实验组小鼠的运动距离和时间相比安慰剂组和空白组要更短，行动要更迟缓，转棒疲劳仪上安慰剂组和空白组小鼠明显能在仪器上停留更久的时间，抓力实验中实验组小鼠总体的抓力水平要更低，跑台实验中实验组小鼠表现的运动更迟缓，平衡感也更差。所以可以得出给小鼠喂食Cuprizone利用其毒性诱导来建立多发性硬化症老鼠模型是可行。同时在这几项实验组安慰剂组和空白对照组的表现没有明显差异，因此可以排除溶剂成分MC的影响。

关键词：多发性硬化症 Cuprizone 灌胃 老鼠模型

1. 4

第1章 绪论 5

1.1多发性硬化症的疾病介绍 5

1.2现在常用的三种多发性硬化症动物模型 6

第2章 小鼠模型的构建 10

2.1材料与方法 10

2.1.1 实验材料 10

2.1.2实验方案 10

2.1.3实验小鼠行为状态评分 10

2.2行为学检测 13

2.2.1 旷野实验 13

2.2.2 转棒法实验 14

2.2.3 抓力实验 14

第3章 结果与讨论 15

3.1实验结果 15

1.1. 3.2 分析与讨论 16

Abstract

In this study, mice were fed with Cuprizone by oral gavage to establish a model of multiple sclerosis by using its toxicity induction to verify the reliability of this improved mouse model of multiple sclerosis.This provides a more efficient and cost-effective option for animal models in the study of new drugs and in the pathology of disease pathology.In this experiment, mice were randomly divided into three groups of 6 each.One group was intragastrically administered once daily with Cuprizone-MC (methylcellulose) suspension, one group was administered with MC once as a placebo control group, and the last group was intragastrically administered with water as a blank control.The concentration of Cuprizone used in the experiment was 0.2%, and the concentration of MC was 0.1%. At the same time, the neurological function scores should be performed before the gavage operation to observe the symptoms and changes of the mice.At the end of the gavage, behavioral tests were performed on each group of mice, including Open Field, Rotating Rod Experiment, Grip Experiment and Treadmill Experiments.The behavioral differences between the experimental group and the control group were observed by four behavioral experiments to verify the reliability of the animal model of multiple sclerosis by Cuprizone.The final result also shows that the difference does exist. The neurological function score shows that the scores of the experimental group are generally high and show some development trend. The distance and time of the experimental group of mice in the open field experiment compared with placebo.The placebo group and the blank group of mice on the rotating rod fatigue meter can obviously stay on the instrument for a longer period of time.In the grip test, the overall grip strength of the mice in the experimental group was lower. In the treadmill experiment, the mice in the experimental group showed slower movement and worse balance.Therefore, it can be concluded that it is feasible to feed the mice with Cuprizone using its toxicity induction to establish a mouse model of multiple sclerosis.At the same time, there was no significant difference in the performance of the placebo group and the blank control group in these experimental groups, so the influence of the solvent component MC could be excluded.

Key Words：multiple sclerosis Cuprizone oral gavage mouse model

1. 绪论

1.1多发性硬化症的疾病介绍

多发性硬化症(MS)是中枢神经系统(CNS)的一种慢性炎症、脱髓鞘和神经退行性疾病。MS是一种由复杂的基因-环境相互作用引起的异质性、多因素、免疫介导的疾病.MS的病理标志是脱髓鞘病变的累加，常出现在脑和脊髓的白质和灰质中。MS的临床表现和病程参差不齐，在大多数MS患者初期通常会持续数天或数周的可逆性神经功能缺陷，随着时间的推移，永久性神经功能缺陷的扩大和在临床上逐渐失去行动能力的现象变得突出，称为次级进展性MS（SPMS）。而少数患者从一开始就有一个逐渐恶化的疾病过程，这被称为原发性进展性MS(PPMS)。MS的病理特征是脑和脊髓脱髓鞘病变的形成，这可能与神经轴突损伤有关。多发性硬化症通常在青壮年时期发病较多，发病年龄一般在20岁至40岁之间。而有些患者儿童期或青少年期就经历了最初的脱髓鞘事件[^[2]]，尤其女性发病率较高。多发性硬化病变比较弥散，因此症状和体征也比较复杂，可出现神经炎、球后视神经炎、眼肌麻痹、肢体瘫痪、锥体束征及精神症状。多发性硬化症给社会带来沉重负担，原因是现有治疗费用高昂，病人及其照顾者的就业前景和工作保留率较低。

MS的病因尚不清楚，该疾病是遗传易感性和环境危险因素相互作用的结果。许多环境因素可能会导致多发性硬化症的发生，因此在特定的时间范围内增加了疾病的风险。而且某些因素可能与生命的特殊阶段有关，例如怀孕期间维生素D水平较低。同时有大量证据证明青春期多发性硬化症易受环境危险因素影响[^[3]]。要确定MS患者的生活方式或受到环境危险因素的作用是非常困难的，除了少数特例外，大规模的研究是很罕见的。目前最常见的危险因素是青春期和成年早期的Epstein-Barr病毒感染，通过主动或被动吸烟接触烟草，缺乏阳光照射，缺乏维生素D以及肥胖。其他危险系数较低的风险因素包括夜间工作、过量饮酒或饮用咖啡因以及有感染单核细胞增多症的病史。而在遗传学方面，家庭内部的复发率随基因共享率的增加而增加[^[4]]。例如，同卵双生子患病风险为35%，异卵双生子为6%，兄弟姐妹中为3%。MS的遗传性涉及到多个基因，每一个基因都与疾病风险的微小增加有关。其中HLA I类和HLA的多态性 II类基因有表达MS的最高风险。

所有MS表型的病理特征都是局灶性斑块(也称为病灶)，这是脱髓鞘的区域，通常位于毛细血管小静脉周围，并具有特征性的血脑屏障破裂[^[5]]。血脑屏障破裂机制尚无法完全阐明，但是可以观测到由促炎性细胞因子和内皮细胞产生的趋化因子(如肿瘤坏死因子、白细胞介素1β和白细胞介素6)直接产生的以及细胞因子-依赖性和趋化因子-依赖性白细胞介导间接产生的损伤[^[6]]。血脑屏障的失调增加了活化的白细胞(包括巨噬细胞、T细胞和B细胞)向中枢神经系统的跨内皮迁移，从而导致进一步的炎症和脱髓鞘，伴随而来的是少突胶质细胞丢失、反应性胶质增生和神经-轴突变性。斑块既存在于白质，也存在于灰质，通常见于中枢神经系统。

T细胞介导的MS复发的传统观点已经有所发展，包括了几种免疫细胞类型之间关键的双向相互作用的参与，包括外周的T细胞、B细胞和髓样细胞，以及小胶质细胞和星形胶质细胞等中枢神经系统的常驻细胞。与外周免疫细胞一起，中枢神经系统常驻细胞分泌一系列炎症介质，可将炎症细胞募集到中枢神经系统中，导致神经元脱髓鞘和中枢神经系统实质内炎症[^[7]]。此外，外周和中枢神经系统各自的炎症机制也参与了MS的病理生理学过程。特别的，中枢神经系统驻留细胞，主要是微胶质细胞和星形细胞可感觉到稳态干扰，产生神经毒性炎症介质(如细胞因子、趋化因子和活性氧)。可促进和维持MS中的神经变性轴突损伤和神经变性。尽管认为炎症可能导致中枢神经系统损伤，但目前可用的治疗方法对它的靶向性很低，需要进一步研究。

中枢神经系统脱髓鞘是多发性硬化症(MS)的标志。在此基础上，定义了四种基本不同的脱髓鞘形态：髓鞘蛋白丢失，斑块的延伸，少突胶质细胞破坏，出现显示补体激活的免疫病理证据。Ⅰ型和Ⅱ型以免疫介导的炎症为主，Ⅲ型和Ⅳ型主要由原发性少突胶质细胞病诱发。虽然脱髓鞘后再髓鞘化经常发生，但通常是不完全的。因此，MS研究面临的挑战之一是探究髓鞘再生失败的原因，并制定促进髓鞘再生的方案。而且尽管有几个遗传和环境风险因素在发挥重要作用，但是目前还没有明确MS发病的具体原因。在此背景下，动物模型是研究脱髓鞘和再髓鞘形成的机制和研究细胞在这些过程中的反应和相互作用的一个有价值的工具，从而提供了一个阐明可能的治疗靶点的平台。

1.2现在常用的三种多发性硬化症动物模型