摘 要

利用金属螯合磁珠可以一步纯化与固定化组氨酸标签蛋白。该固定化方法简单快捷，且无需前处理以及纯化步骤，可用磁场实现靶向输送。本文设计并制备两种新型金属螯合磁珠，并将其成功应用于DspB的一步法分离纯化与固定化。本文的主要研究内容与结果如下：

（1）金属螯合磁珠的制备与表征

通过共沉淀法制备纳米Fe₃O₄，并在其表面包裹SiO₂层。分别通过KH900和氯乙酸钠液液反应以及KH550和环氧氯丙烷、亚氨基二乙酸液液反应形成两种螯合配体连接体,再通过固液反应，将上述螯合配体连接体连接于磁珠上，并螯合Ni² ，获得了Fe₃O₄-SiO₂-ECH-IDA-Ni² 和Fe₃O₄-SiO₂-TED-Ni² 两种新型金属螯合磁珠。表征结果表明：所合成磁珠的主体晶型为四氧化三体立方晶型，平均粒径分别为281.7±4.6 nm以及281.7±3.3 nm，表面包裹二氧化硅层，并修饰有机基团。同时所制备两种磁珠具有良好的磁响应性以及超顺磁性。

（2）DspB的一步纯化与固定化后酶活性研究

磁珠固定化酶与游离酶的最适温度同为40℃。在较大的温度范围内，两种磁珠固定化酶显示出更高的相对活性。固定化酶的最适pH为5.5，游离酶的最适pH为5，其中固定化酶能够更加耐受碱性环境。此外在固定化处理后，酶与底物之间的亲和力有所增加。实验表明固定化处理增强了DspB的稳定性。金属螯合磁珠可作为一种良好的磁性载体材料，应用于分散蛋白B的一步纯化与固定化。

关键词：细菌生物被膜相关感染；分散蛋白B；金属螯合磁珠；一步纯化与固定化

Abstract

One-step purification and immobilization of histidine tag proteins can be achieved by metal-chelated magnetic beads. This immobilization method is more simple and faster compared with traditional immobilizing methods because it does not require complex pretreatment and purification procedures so that it is promising in industrial applications. Herein, we designed and synthesized two novel metal-chelated magnetic beads, and applied them to the one-step purification and immobilization of DspB. The main research contents and conclusions are as follows.

(1) Preparation and characterization of metal-chelated magnetic nanoparticlesFirstly, nano-Fe₃O₄ was synthesized by coprecipitation and then coated with the SiO₂ layer. Secondly, two chelating ligands were prepared by the liquid-liquid reactions of KH900 with sodium chloroacetate and KH550 with epichlorohydrin and iminodiacetic acid. The above mentioned chelating ligands were then connected to the magnetic nanoparticles by the solid-liquid reaction. After chelating Ni² , the two new metal-chelated magnetic beads, Fe₃O₄-SiO₂-ECH-IDA-Ni² and Fe₃O₄-SiO₂-TED-Ni² , were finally synthesized. The characterizing results show that the main crystal form of magnetic nanoparticles is Fe3O4 cubic crystal, and their hydrated particle diameters are respectively 281.7±4.6 nm and 281.7±3.3 nm. The two magnetic nanoparticles were coated with SiO2 and modified with organic groups. Moreover, they also have good magnetic response and superparamagnetism.

(2) Study on the effect of immobilization

The optimum temperature of the two magnetic beads immobilized enzymes is the same as that of free enzymes, both of which are 40℃. In the higher temperature range, the immobilized enzyme shows higher relative activity. The optimum pH of activity of the immobilized enzyme and free enzyme are 5.5 and 5, respectively. Also, after immobilized treatment, the affinity between enzyme and substrate increases. The experimental results show that the immobilized treatment enhances the stability of DspB. Metal-chelated magnetic nanoparticles can be used as a good magnetic carrier material for one-step purification and immobilization of DspB.

Key Words：Bacterial biofilm-related infections；DspB; Metal-chelated magnetic nanoparticles；one-step purification and immobilization

目录

第1章 绪论 1

1.1生物被膜与相关顽固性感染 1

1.2分散蛋白B 1

1.3 金属螯合磁珠 2

1.3.1 固定化金属亲和层析 2

1.3.2 金属螯合磁珠简介 3

1.3.3金属螯合磁珠应用于蛋白一步纯化与固定化 3

1.3.4 金属螯合磁珠研究进展 4

1.3.4.1 常见磁性内核及其制备方法 5

1.3.4.2 基底层 6

1.3.4.3 螯合配体 8

1.3.3.4 金属离子 9

1.4本文研究的主要目标与意义 10

第2章 金属螯合磁珠的制备与表征 11

2.1 试剂与仪器 11

2.1.1 实验试剂 11

2.1.2 实验仪器 12

2.2.2 各步反应产物的表征 15

2.3 结果与讨论 15

2.3.1 磁珠的微观形貌 15

2.3.2 红外光谱 15

2.3.3 粒径分布 16

2.3.4 X射线衍射图谱 17

2.3.5 磁滞回线 18

2.4 小结 19

第3章 DspB的一步纯化与固定化 20

3.1 试剂与仪器 20

3.1.1 菌种 20

3.1.2 实验试剂 20

3.1.3 实验仪器 21

3.2 实验方法 21

3.2.1 DspB重组大肠杆菌的培养与破碎 21

3.2.2 Bradford法测定蛋白质含量 22

3.2.3 固定化酶以及游离酶的制备 23

3.2.4 酶活测定 23

3.2.5 磁珠结合DspB选择性实验 23

3.2.6 咪唑溶液对磁珠上目标蛋白的梯度洗脱研究 23

3.2.7 DspB固定前后，酶活与温度的关系研究 24

3.2.8 DspB固定前后，酶活与pH的关系研究 24

3.2.9 DspB固定前后酶反应动力学 24

3.3 结果与讨论 24

3.3.1 磁珠结合DspB选择性实验 24

3.3.2 咪唑溶液对磁珠上目标蛋白的梯度洗脱研究 25

3.3.3 DspB固定前后，酶活与温度的关系研究 27

3.3.4 DspB固定前后，酶活与pH的关系研究 27

3.3.5 DspB固定前后，酶反应动力学 28

3.4 小结 28

第4章 总结与展望 30

4.1 总结 30

4.2 展望 30

参考文献 32

致谢 37

第1章 绪论

1.1生物被膜与相关顽固性感染

生物被膜是一种由细菌群体及自身分泌的胞外聚合物基质组成的多层网状结构集合体^[1]，其固着于细菌存在的物体或活性组织表面，对细菌生长起到机械支撑保护功能，同时介导细菌之间以及细菌与外界环境之间的相互作用^[2]。成熟的生物被膜通过这种高度组织化的多层复合结构可以有效的降低多种抗菌剂的渗透，使细菌菌群对抗菌物质产生抗性，并且能抵抗多种免疫分子的作用，从而逃离机体免疫系统的清除。因此，临床上常有顽固性细菌感染发生，其他领域（如食品加工等）也有难以清除的顽固性细菌生长^[3-4]。

细菌胞外分泌成分主要为多糖，其中一种名为细胞间多糖黏附素（Polysaccharide Intercellular Adhesion, PIA）的己糖胺类基质多糖被发现存在于多种葡萄球菌以及大肠杆菌中。PIA的基本单元为N-乙酰-D-氨基葡萄糖，并通过β（1，6）糖苷键连接形成直链结构。同时这些单体在分子量、脱乙酰化程度、乙酰柠檬酸三乙酯取代基方面具有物种差异^[5]。在生物被膜的形成过程中，多条多糖链主要通过氢键、静电相互作用吸附于细菌细胞表面，在生物被膜内部形成多种不同的形态结构，与包括脂质、蛋白质、凝集素等多种生物分子作用，共同组成复杂而立体的网状结构^[6]。此外，PIA在介导细菌黏附、促进生物膜成熟以及抵御机体免疫清除方面具有极为关键的作用^[7]。因此，通过降解细胞外多糖，阻断生物被膜形成或降解生物被膜结构，是解决细菌生物被膜相关感染问题一个很好的切入角度^[8-9]。