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摘 要

生物大分子（如DNA）在固/液界面上的动态行为对其生物功能尤为重要，已成为近年来的研究热点。单分子荧光检测技术常运用荧光染料标记来显示与追踪单个生物大分子的动态行为、构象变化以及分子间碰撞。传统的分析测试方法只能获得大量分子的平均综合效应，而单分子荧光检测能实现对生物大分子的单分子操控，将系综平均实验掩盖的信息挖掘出来。单分子荧光检测已广泛应用于药理学、生物化学、高分子科学、物理化学等领域，成为了研究复杂体系动态机制的有力手段。本论文综述了单分子荧光技术在DNA与表界面相互作用研究中的应用。

关键词：单分子；DNA；界面

Abstract

The dynamic behavior of biological macromolecules (such as DNA) at the solid/liquid interface is particularly important for their biological functions, and has become a research hotspot in recent years. Single-molecule fluorescence detection techniques often use fluorescent dye labels to display and track the dynamic behavior, conformational changes, and intermolecular collisions of single biological macromolecules. Traditional analysis and testing methods can only obtain the average comprehensive effect of a large number of molecules, and single-molecule fluorescence detection can achieve single-molecule manipulation of biological macromolecules, and excavate the information covered by the ensemble average experiment. Single-molecule fluorescence detection has been widely used in pharmacology, biochemistry, polymer science, physical chemistry and other fields, and has become a powerful means to study the dynamic mechanism of complex systems. This paper reviews the application of single-molecule fluorescence technology in the study of the interaction between DNA and surface interface.

Keywords: single molecule; DNA; surface

目 录

第一章 绪论 1

第二章 单分子荧光检测的意义 2

第三章 荧光发射的原理 3

第四章 DNA的固定与荧光检测 5

第五章 单分子荧光检测的方法 8

5.1宽场落射式荧光显微镜 8

5.2激光扫描共聚焦荧光显微镜 9

5.3全内反射荧光显微镜 10

5.4扫描近场光学显微镜 12

第六章 DNA在固液界面的单分子成像 14

6.1玻璃表面 14

6.2纳米薄膜表面 14

6.3细胞膜表面 15

6.4 电极表面 16

第七章 总结与前景 18

参考文献 19

致 谢 21

第一章 绪 论

DNA、蛋白质等生物大分子在液/固界面的动力学行为研究尤为重要。例如，在蛋白、单分子成像和细胞信号转导等研究中，DNA和其他生物大分子在各种不同基底上的非特异性吸附能力会影响检测的准确性；在分离系统中，生物分子的分离效果还取决于生物分子与液-固界面之间的吸附程度；在液体的铺展过程中，溶液的浓度还会影响液体与界面的接触角大小。生命的基本过程取决于细胞中各种分子之间的相互协调。为了理解生命的基本过程，有必要在单分子水平上理解物质和生命过程之间密切的相互作用。单分子检测(SMD)可以在单分子水平上研究单个分子的构型变化，分子之间的碰撞与排斥以及单分子操纵等现象。经过四十多年的发展，SMD凭借其高灵敏度、高空间与时间分辨率等优势，迅速成为了当前物理化学、药理学等领域的研究热点。

图1.1 DNA与各种纳米材料的结合^[1]

单分子荧光检测是SMD技术中最敏感的方法之一^[2]。常见的荧光染料包括香豆素、碳氟化合物、罗丹明、菁等。这些荧光染料由于荧光量子产率较高，易修饰功能基团，同时具有良好的光稳定性、生物相容性及其他生物特性，在各种小分子荧光探针的设计和合成中被广泛用作荧光信号基团。1976 年，Hirschfeld^[3]{T, 1976 #2}{T, 1976 #2}用80~100个荧光素异硫氰酸酯分子标记单个抗体，首次用全内反射光学方法实现了多染料标记的单分子荧光检测，并对单分子检测技术进行了一系列优化，使检测到的分子数量不断提高。1989年，Moerner^[4]等人第一次观察到掺入分子晶体中的单个分子在低温下发出的荧光。1990年，Shera^[5]等人通过进一步提高荧光收集效率，第一次实现了室温条件下溶液中单分子的荧光检测。从那时起，在溶液中单分子荧光成像技术发展越发迅速，在室温条件下趋于成熟。1995年，Funatsu^[6]等利用全内反射显微镜观察到水溶液中用荧光染料标记的蛋白分子并跟踪其运动轨迹，真正实现了单荧光分子的SMD检测。

利用单分子技术研究大分子如DNA在液/固界面的吸附动力学过程，有助于科学家们对微观世界进行更深入的观察，对于研究DNA转录、细胞信号转导等生物化学反应具有重要意义。

第二章 单分子荧光检测的意义

在一个由同种分子组成的均相系统中，当实验的测量时间足够长时，宏观测量和单分子测量的结果理论上是相同的。然而，在异质系统中，个体的平均运功轨迹与总体的平均运动轨迹往往并不相同。即使是在稳定的均相体系，如溶液中，实际测量时间与波动时间也常不同，从而导致不均匀的整体测量和单分子测量结果。

图2.1 麦克斯韦速率分布曲线^[7]

与集成测量相比，SMD具有以下多种优点^[8]：

1. 单分子检测技术的研究系统可能处于整体的平衡体系之中，但这往往是一种动态平衡，个体在体系中仍保持各自的运动方式在平衡状态上下波动，单分子检测技术能观察整体平均中存在的某些局部差异，并跟踪监控单分子的微观动态变化。对于异质系统，可以更直观地给出分子层面的分布信息。
2. 对于均质和非均质系统，单分子检测都能得到分子水平上结构与性质发生波动的直观记录，输出信号中通常包含丰富的动力学与热力学知识。在对多个单分子进行大量测量并取得数据后，我们能借助它构建一个出现频率与波动变化的图谱。这个图谱反映的信息比仅仅通过宏观测量得到的平均值所涵盖的信息要丰富、可靠得多。
3. 由于在随时间变化的过程中同一系统中各个分子的分布与运动状态并不会保持严格一致，因此SMD技术可以实时检测反应路径，通过微观观察捕获某些被宏观信息淹没的反应中间体或过渡态，并对具有特殊行为的分子进行大规模的筛选，以最高的灵敏度对其结构进行全面深入的检测。

第三章 荧光发射的原理^[9]

荧光是光致发光的一种冷发光现象，包括吸收和发射两个过程。当常温物质受到一定波长的入射光照射时，物质吸收光能并被激发后会发出不同波长的光。当入射光停止照射后，电子不再被激发，发光现象很快就消失。溶液酸碱度、温度、溶剂极性与介电常数等都会使化合物的荧光发生变化。

图3.1 荧光原理图^[9]

荧光发射的原理如图2所示。S0代表基态、S1表示第一电子激发的单线态，S2表示第二电子激发的单线态，T1为第一电子激发的三线态。在分子接受光照后，一部分电子被激发到较高能量的电子态，如S1或S2态，然后其中的大部分分子通过振动弛豫和内部转换返回到S1态，再发射荧光光子分子回归基态S0。当然，分子也可能从第一电子激发单线态跳至三线态，然后跳回S0并发出磷光。由于从S1体系到T1体系的跃迁会使物质的荧光量子产率降低，分子荧光寿命缩短，当电子经过弛豫跃迁至T1态时，分子的荧光会变得非常弱，甚至有可能形成荧光暗态。物质自身的分子结构、所处的微环境的极性与黏度都会影响物质的荧光寿命。通过实时监测物质的荧光寿命能够侧面反映研究系统的状态变化。因此，在溶解荧光物质对其进行荧光寿命检测时，需要严格控制实验温度、溶液浓度、溶剂极性与介电常数等条件。例如，在相同条件下溶解不同物质的量的样品荧光物质，随着物质的量增加，溶液的荧光强度也会增加。但当荧光物质的量增加到某一临界值时，就会由于自吸收，导致荧光淬灭的现象发生。

荧光标记技术^[10-11]是指通过化学键结合或物理吸附等方式标记研究对象 (核酸、多肽、蛋白质等)使其具备荧光特性，并通过观测其在实验过程中的荧光特性侧面反映研究对象的分布与状态的技术。荧光标记技术最初被应用于标记抗体，通过观察抗体与抗原的特异性结合来检测相应的抗原。随着现代生物化学技术的不断发展，新型荧光化合物的合成和各种先进的荧光检测技术的应用，荧光标记技术由于具有无放射性、操作简单、灵敏度高、选择性好等优点，在细胞物质检测、细胞信号传递、药物分析、蛋白质立体结构研究等多种领域取得了快速的发展。

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