论文总字数：20386字

摘 要

随着现在人们对健康绿色的追求更加迫切，L-鸟氨酸这一类对人体有利的氨基酸的需求也在与日俱增，然而工业生产L-鸟氨酸的副产物和工业污染同样令人担忧，所以利用生物方法生产鸟氨酸是一种非常符合社会需求的一种生产方式。

本篇论文利用代谢工程改造解淀粉芽孢杆菌来达到高效合成鸟氨酸的目的，首先对L-鸟氨酸的概况、应用、生物合成的研究进展、解淀粉芽孢杆菌的优势、研究意义和研究内容进行了阐述。然后构建质粒运用CRISPR敲除方法将pgsBCA基因敲除掉，再构建菌株将argF和argI两个基因敲除掉得到工程菌株。对培养基条件优化和发酵优化。最终得到最优发酵条件下即菊粉粗提液和蛋白胨分别为120 g/L和60 g/L，KH2PO4的最佳浓度2 g/L ，MgSO₄的最佳浓度0.4 g/L，K₂HPO₄•3H₂O的最佳浓度20 g/L，MnSO4•H2O的最佳浓度0.02g/L，菌量5 %，装入菌液的量为50 ml（500 ml摇瓶），32 °C ， pH 7.0时工程菌株达到L-鸟氨酸的产量最高达到8.36±0.16 g/L。

关键词： 代谢工程 解淀粉芽孢杆菌 L-鸟氨酸 CRISPR敲除方法 发酵优化

Efficient synthesis of ornithine by Bacillus amylolyticus through metabolic engineering

Abstract

With the more urgent pursuit of health and green, the demand for L-ornithine, a kind of amino acid beneficial to human body, is increasing day by day. However, the by-products of industrial production of L-ornithine and industrial pollution are also worrisome, so the production of ornithine by biological method is a kind of production method which is very in line with social needs.

In this paper, metabolic engineering was used to improve the production of L-ornithine. Firstly, the general situation, application, research progress of biosynthesis, advantages, research significance and research content of ornithine were described. Then the constructed plasmid was knocked out of pgsBAC gene by CRISPR knockout method, and then the constructed strain knocked out the two genes argF and argⅠ to get the engineering strain. Then the fermentation conditions were optimized, including the optimization of culture conditions and medium. At last, under the optimal fermentation conditions, the best concentration of inulin and peptone were 120 g/L and 60 g/L respectively, the best concentration of MgSO4 was 0.4 g/L, the best concentration of MnSO4 · H2O was 0.02 g/L, the best addition of K2HPO4 · 3H2O was 20 g/L, the best concentration of KH2PO4 was 2 g/L, the inoculation amount was 5 %, and the liquid content in 500 ml shaker was 50 ml, 32 °C, pH value At 7.0, the highest yield of L-ornithine was 8.36 ± 0.16 g/L.

Key words: metabolic engineering; L-ornithine; CRISPR knockout method; fermentation optimization

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 绪论 1

1.1 L-鸟氨酸的介绍 1

1.2 L-鸟氨酸的应用 1

1.2.1 在食品工业上的应用 1

1.2.2 在生物医学上的应用 1

1.3 L-鸟氨酸的合成方法 2

1.3.1 化学合成法 2

1.3.2 生物合成法 2

1.4 生物法合成L-鸟氨酸的研究进展 3

1.5 解淀粉芽孢杆菌作为目的菌株的优点 3

1.6 研究意义与研究内容 4

1.6.1 研究意义 4

1.6.2 研究内容 4

第二章 材料与方法 5

2.1 菌株与质粒 5

2.2 培养基与缓冲溶液 6

2.2.1 培养基 6

2.2.2 缓冲溶液 6

2.3 主要试剂及工具酶 7

2.3.1 主要试剂及试剂盒 7

2.3.2 工具酶 7

2.4 主要实验仪器 7

2.5 实验方法 8

2.5.1 质粒构建 8

2.5.2 感受态的制备及电转 9

2.5.3 敲除方法 9

2.5.4 pcr方法 9

2.5.5 凝胶电泳验证 10

2.5.6 鸟氨酸、生物量、总糖的测定 11

2.5.7 酶切 12

第三章 结果与讨论 14

3.1 构建用于敲除pgsBCA基因的重组质粒pDR-Cas9n-sgRNApgs-pgsL-pgsR 14

3.2 合成L-鸟氨酸的解淀粉芽孢杆菌菌株的构建 14

3.3 敲除pgsBCA基因对菌株合成鸟氨酸的影响 16

3.4 发酵条件的优化 17

3.4.1 培养基优化对L-鸟氨酸合成的影响 17

3.4.2 培养条件的优化 20

第四章 结论与展望 23

4.1 结论 23

4.2 展望 23

参考文献 24

致 谢 27

第一章 绪论

1.1 L-鸟氨酸的介绍

L-鸟氨酸^[1]（ornithine）(C₅H₁₂N₂O₂)不属于人体所必须的氨基酸，也不可以从蛋白质中提取，但是可以从抗菌性肽中提取出，例如短杆菌肽。此外它是碱性氨基酸的一种。与此同时L-鸟氨酸可以有精氨酸水解得到，也是脯氨酸的合成物质，在人体内参与尿酸循环也。进入21世纪后,L-鸟氨酸在食品和医药上有着更广泛的应用 ^[2]，L-鸟氨酸上除与精氨酸一起配置饮料（恢复疲劳），还用作于试剂和注射液。L-鸟氨酸拥有非常好的发展前景。

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