论文总字数：22513字

摘 要

溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠病（IBD）的一种，是以严重腹泻、意外体重减轻、血便、腹痛、乏力为特征的消化道常见疾病，目前已知其具有多种发病机制，但可用的治疗方法仍然有限。纳豆激酶（Nattokinase，NK，E.C.3.4.21.62）是一种由枯草芽孢杆菌natto产生的丝氨酸蛋白酶，是纳豆中最活跃的功能性成分，被广泛用作医疗保健的营养补品。在这项研究中，我们评估了NK对2%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠慢性结肠炎（uicerative colitis, UC）发展的影响，通过循环自由饮用2% DSS建立小鼠慢性结肠炎模型。实验结束后，取小鼠结肠组织，用Hamp;E染色观察结肠组织的病理变化。采用Elisa检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6在结肠组织中的表达情况。通过Western Blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax，紧密连接蛋白Claudin-1及ZO-1的表达情况。实验结束后通过测量小鼠结肠长度对比发现给予NK可以明显改善UC导致的结肠缩短。Hamp;E染色显示模型组黏膜完整性受到破坏，上皮细胞损伤，出现了明显的黏膜溃烂，而给药组明显降低了黏膜损伤，有效的保持了肠黏膜的完整性。与模型组相比，给予NK和5-ASA组的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达下降，Bax表达下调，细胞凋亡减少；Claudin-1及ZO-1表达上调，紧密连接增加。综上所述，这些实验结果表明纳豆激酶能明显抑制DSS诱导的小鼠慢性结肠炎发生，改善炎症症状，维持肠黏膜完整性，对于UC治疗有积极作用。

关键字：纳豆激酶 慢性结肠炎 炎症因子 5-氨基水杨酸 细胞凋亡 紧密连接

Nattokinase inhibits DSS-induced chronic colitis in mice

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic and recurrent intestinal inflammatory disease with multiple pathogenesis and available treatment methods are still limited. Nattokinase (Nattokinase, NK, E.C.3.4.21.62) is a serine protease produced by Bacillus subtilis natto. It is the most active functional component in natto and is widely used as a nutritional supplement for medical care. In this study, we evaluated the effect of NK on the development of 2% dextran sodium sulfate (DSS) -induced chronic colitis (UC) in mice, and established a chronic colon in mice by freely drinking 2% DSS Inflammation model. After the experiment, the mouse colon tissue was taken and stained with H amp; E to observe the pathological changes of the colon tissue. Elisa was used to detect the expression of inflammatory factors TNF-α, IL-1β and IL-6 in colon tissue. The expression of anti-apoptotic protein Bcl-2, pro-apoptotic protein Bax, tight junction proteins Claudin-1 and ZO-1 were detected by Western Blot. After the experiment, by measuring the length of the colon of mice, it was found that administration of NK can significantly improve colon shortening caused by UC. H amp; E staining showed that the mucosal integrity of the model group was damaged, epithelial cells were damaged, and obvious mucosal ulcers appeared, while the drug administration group significantly reduced mucosal damage and effectively maintained the integrity of the intestinal mucosa. Compared with the model group, the inflammatory factors express in the NK and 5-ASA groups was decreased, Bax expression was down-regulated, and apoptosis was reduced; Claudin-1 and ZO-1 were up-regulated and closely The connection increases. In summary, these experimental results show that nattokinase can significantly inhibit DSS-induced chronic colitis in mice, improve inflammation symptoms, maintain intestinal mucosa integrity, and have a positive effect on UC treatment.

Keyword：Nattokinase; chronic colitis; inflammatory factor; 5-aminosalicylic acid; apoptosis; tight junction

前言

目前我国慢性结肠炎发病率呈增高的趋势，且长期的慢性炎症诱导为结直肠癌的概率也在不断增加。临床一线药物治疗方法均有副作用风险，且对部分患者并无治疗作用，还有停药后易复发，经济负担重等缺点。因此，新的UC治疗方法的开发非常迫切。血液的浓稠性、黏滞性和聚集性在结肠炎患者中显着增高，肠黏膜血管血液灌流量减少，导致肠黏膜细胞缺血，进而缺氧坏死，引起肠黏膜组织损伤并导致炎症发生。而纳豆激酶由于其高效溶栓作用，调节血流微循环，抗炎抗氧化作用，并可长期服用无副作用，我们提出长期服用纳豆激酶可以改善结肠炎所导致的肠道损伤和炎症的猜想。目前研究表明NK的优点包括经证实的安全性、长期的人类消费史、口服给药的方便性（许多抗血栓药物是可注射的）、易于大规模生产等。关于NK的多个临床试验已经进行或批准进行，这一事实为人类受试者给药的安全性提供了一个很好的指示。NK可采用枯草杆菌发酵的方法直接生产得到，具有很好的市场推广潜力。

目录

摘要 I

Abstract II

前言 IV

第一章 绪论 2

1.1 本课题的研究目的与意义 2

1.2 纳豆激酶的结构 3

1.3 纳豆激酶的作用机理 4

1.4 影响慢性结肠炎形成的因素 4

1.5 慢性结肠炎治疗现状 5

第二章 实验材料和方法 7

2.1 实验材料 7

2.2.1实验动物 7

2.2.2主要仪器设备 7

2.2.3实验试剂 8

2.2实验方法 9

2.2.1建立小鼠慢性结肠炎模型 9

2.2.2测量小鼠结肠长度 9

2.2.3结肠组织Hamp;E染色 10

2.2.4酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎症因子 11

2.2.5 Western Blot检测蛋白表达 12

第三章 实验结果与数据处理 14

3.1小鼠状态观察 14

3.2小鼠体重变化 14

3.3小鼠结肠长度 15

3.4小鼠结肠组织HE染色 15

3.5 Elisa检测炎症因子 16

3.6 Western Blot检测蛋白表达 18

结论 20

参考文献 22

致谢 25

第一章 绪论

1.1 本课题的研究目的与意义

慢性结肠炎属于炎症性肠病范畴（inflammatory bowel disease,IBD），慢性结肠炎（uicerative colitis,UC），也称溃疡性结肠炎，UC发病率在全球范围内呈上升趋势[1]，西部地区发病率最高的是加拿大（16.7/100000），而在欧洲，UC发病率从1.6/100000到11.9/100000人不等，北欧国家观察到的患者更多。在东部，虽然UC发病率在增加，但在韩国发病率最高（3.62/100000）。在全球范围内，由于UC的慢性和低死亡率，UC的患病率有所上升，在欧洲每100000人中可达到294人。某些民族更易患UC，但环境因素，如吸烟、口服避孕药、饮食、抗生素、疫苗接种、感染和儿童卫生也起到一定作用。UC可影响任何年龄组，诊断高峰年龄为15-40岁，儿童和老年人也可能患上溃疡性结肠炎[2]，男性和女性的发病率没有明显的差异，大多数UC研究显示性别分布平等[3]。UC常伴有便血和腹泻。常见症状包括急迫、大小便失禁、乏力、大便次数增多、粘液排出、夜间排便和腹部不适；还可注意发烧和体重减轻。这些临床表现可能因疾病的严重程度而异[4][5][6]。溃疡性结肠炎是一种影响消化道的难治性炎症，病变主要位于结肠、直肠或整个大肠黏膜。尽管全球UC发病率呈逐渐上升趋势，但对UC患者的治疗仍然没有副作用有限的治疗药物。因此，近年来，UC的发病机制和最佳治疗方法越来越受到关注。目前临床上治疗溃疡性结肠炎的最常用方法主要是通过单独使用或与其他药物联用5-氨基水杨酸类药美沙拉嗪。但一项新的Meta分析指出, 美沙拉嗪目前存在的临床应用缺陷有患者依从性和接受性较差，患者反跳现象明显且不良反应较多、价格较昂贵等问题。美沙拉嗪临床诱导缓解的有效率仅为66.58%[7]。

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