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摘 要

木霉是一种腐生型丝状真菌，主要分布于土壤、植物根际以及叶面之上。常见种类包括长枝木霉，绿色木霉，哈茨木霉等。有研究表明木霉能够广泛地促进于多种植物的生长过程，木霉能够分泌胞外酶类以及次级代谢物质，这些物质在刺激植物的种子萌发与产量的增加过程中发挥重要作用。长枝木霉菌株MD33是本实验室前期从采自贵州赤水野生金钗石斛茎中筛选分离到的具有产石斛碱能力的菌株，但其石斛碱的产量与植物相比还有较大差距，因而，本研究拟通过紫外诱变的方法提高其产石斛碱的能力。

以金钗石斛内生菌MD33为出发菌株，通过致死率（gt;90%）确定最佳紫外诱变时间为120 s，同时以高浓度硫酸铜（200 mg/L）作为筛选压，筛选诱变菌株；筛选出的诱变菌株于PD发酵培养14d后，提取菌丝体中石斛碱，并通过酸性染料比色法测定石斛碱含量；最终筛选岀1株正突变菌株MD33_UV-7；其石斛碱产量为0.2948 μg/mL，是对照组的1.9倍。

关键词：石斛碱 长枝木霉 酸性染料比色法 紫外诱变

Ultraviolet mutagenesis of Dendrobium nobile

endophyte MD33 and determination of dendrobium production

Abstract

Trichoderma sp. are saprophytic filamentous fungi, mainly distributed in soil, plant rhizosphere and leaf surface. Common species include Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma green, Trichoderma hartz. As an important biocontrol factor, Trichoderma sp. can effectively inhibit many plant pathogens. Trichoderma sp. can secrete extracellular enzymes and secondary metabolites, which play an important role in biological control. Trichoderma longibrachiatum MD33 was a strain with dendrobium-producing ability screened and isolated from the stems of wild Dendrobium nobile collected from Chishui city, Guizhou province. But its dendrobium production was still quite different form that of plants, Therefore, this study intends to improve the ability of dendrobium production by Ultraviolet mutagenesis.

The specific scheme was as follows: taking endophyte MD33 of as the starting strain, thebest mutagenesis time was determined to be 120s through the fatality rate (gt; 90%). At the same time, high concentration of copper sulfate (200 mg/L) was used as screening pressure to screen mutagenesis strains. Dendrobium was extracted from mycelium after 14 days of fermentation in potato glucose medium (PD), and the dendrobium content was determined by acid dye colorimetry. Finally, a positive mutated strain MD33_UV-7 was screened. The yield of dendrobium was 0.2948 μg/mL, 1.9 times higher than the starting bacteria, and the genetic characters of dendrobium were stable.

Keywords: Dendrobinum; Trichoderma longibrachiatum; Acid dye colorimetry; UV mutagenesis

目录

摘要 I

Abstract Ⅱ

目录 Ⅲ

第一章 文献综述 1

1.1 金钗石斛简介及主要成分 1

1.2 金钗石斛化学成分研究 1

1.3 木霉菌简介 2

1.3.1 木霉—植物的相互作用 2

1.3.2 长枝木霉 3

1.4 微生物诱变育种 4

1.4.1 物理诱变 4

1.4.2 化学诱变 4

1.5 研究内容与意义 5

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 实验菌种 6

2.1.2 培养基 6

2.1.3 试剂与仪器 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 实验前期准备 7

2.2.2 菌株的培养 7

2.2.3 孢子悬液的制备 7

2.2.4长枝木霉MD33紫外诱变 7

2.2.5 高产菌株的筛选 8

2.2.6 酸性染料比色法测定石斛碱 8

第三章 结果与讨论 9

3.1 长枝木霉MD33形态观察 9

3.1.1 MD33菌株的显微形态观察 9

3.1.2 接种活化后菌丝菌落形态观察 9

3.2 长枝木霉MD33紫外诱变 10

3.2.1 紫外诱变时间的确定 10

3.2.2 突变菌株筛选 11

3.2.3 紫外诱变前后菌株形态观察 11

3.2.4 液体培养MD33菌株形态观察 12

3.2.5 突变菌株石斛碱含量测定 12

第四章 结论与展望 15

4.1 结论 15

4.2 展望 15

参考文献 16

致谢 19

第一章 文献综述

1.1 金钗石斛简介及主要成分

金钗石斛，兰科石斛属，其名源于外形相似于古代女子的发钗。金钗石斛是传统的中药成分，其药效在2015年《中国药典》中有明确规定。其广泛分布于我国的西南地区，包括云南、贵州、四川以及广西等地。金钗石斛的主要成分有多糖类、生物碱类、酚类、倍半萜类、甾体糖苷类、黄酮类以及香豆素类等^[1]。作为一项重要的药材，其有着降血糖、抗衰老、降血脂、抗肿瘤以及改善记忆等药理作用^[2]。

最近20年，石斛属植物受到国内外的研究人员的关注，其在研究中发现石斛属下的植物均含有几种化学成分。针对这些化学成分的特性进行研究，明晰其实际的药理作用的机制以及效果，能够为未来保健产品以及医药产品的研发提供支持。

1.2 金钗石斛化学成分研究

国内外研究人员在过去的20年中一直在探索和研究石斛属植物的化学成分，发现该石斛属类植物含有的化学成分种类丰富。金钗石斛的化学成分主要有生物碱类、多糖类、黄酮类、酚类、倍半萜类、香豆素类及甾体糖苷类化合物，其中石斛碱是其特征性成分^[3]。

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