论文总字数：20860字

摘 要

阿维巴坦是近几年刚研制出的β-内酰胺酶抑制剂，依靠其独特的作用机制，与其它抗生素联合使用，可很大程度上提升这种抗生素的治疗效果，这在抗生素耐药性越来越多的今天有重要意义。然而传统的阿维巴坦合成路径比较繁杂，且需要复杂的手性拆分方法，导致产率较低。但是以顺式-5-羟基哌啶甲酸(cis-5-hydroxypiperidinecarboxylic acid，cis-5-HyPip）为原料合成阿维巴坦，可以很大程度简化反应过程，同时解决手性光学纯度的问题。

近年来生物法合成顺式-5-羟基哌啶甲酸的方法比较受到人们的青睐，本实验选用来自苜蓿中华根瘤菌中的顺式-4-脯氨酸羟化酶的基因SmP4H，得到重组大肠杆菌后，利用其转化L-哌啶甲酸生产顺式-5-羟基哌啶甲酸。选择合适的催化反应体系，包括催化剂类型，反应溶剂的筛选，并对体系中各辅因子(α-KG, FeSO₄·7H₂O, VC)的添加比例进行优化，以期增加L-Pip浓度与转化率。为大规模制备cis-5-Hypip奠定基础。

关键词：顺式-5-羟基哌啶甲酸、生物转化、体系优化、衍生化反应

Biological preparation and product separation of cis-5-hydroxypiperidinecarboxylic acid

Abstract

Avibactam is a β-lactamase inhibitor that has just been developed in recent years. Depending on its unique mechanism of action, it can be used in combination with other antibiotics to greatly improve the therapeutic effect of this antibiotic. More and more medicinal properties are of great significance today. However, the traditional synthetic route of aribabatan is complicated and requires complex chiral resolution methods, resulting in low yields. But cis-5-hydroxypiperidinecarboxylic acid (cis-5-hydroxypiperidinecarboxylic acid, cis-5-HyPip) as a raw material to synthesize aribabatan can greatly simplify the reaction process and solve the problem of chiral optical purity.

In recent years, the biological method of synthesizing cis-5-hydroxypiperidinecarboxylic acid has been favored by people. In this experiment, the gene SmP4H from cis-4-proline hydroxylase in Sinorhizobium meliloti was selected to obtain recombinant large intestine After Bacillus, use it to transform L-piperidinecarboxylic acid to produce cis-5-hydroxypiperidinecarboxylic acid. Choose a suitable catalytic reaction system, including the type of catalyst and the screening of the reaction solvent, and optimize the addition ratio of each cofactor (α-KG, FeSO₄ • 7H₂O, VC) in the system in order to increase the L-Pip concentration and conversion rate. Lay the foundation for large-scale preparation of cis-5-Hypip.

Key words: cis-5-hydroxypiperidinecarboxylic acid. Biotransformation. system optimization. derivatization

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 背景 1

1.2 阿维巴坦 2

1.3 顺式-5-羟基哌啶甲酸（cis-5-hypip） 3

1.3.1 化学合成法 3

1.3.2 生物合成法 4

1.4 立题背景和意义 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌种 7

2.1.2 主要试剂和试剂配方 7

2.1.3 主要仪器 9

2.2 实验方法 10

2.2.1 重组菌的培养 10

2.2.2 产物的分离检测 11

2.2.3 反应体系的选择 12

2.2.4 反应体系的优化 13

第三章 实验结论与分析 15

3.1实验分析与结论 15

3.1.1 全细胞与粗酶液转化的比较 15

3.1.2 反应溶剂的选择 15

3.1.3 细胞浓度对催化反应的影响 16

3.1.4亚铁离子浓度对催化反应的影响 16

3.1.5 VC对催化反应的影响 17

3.1.6 α-KG对催化反应的影响 17

3.1.7 L-Pip对催化反应的影响 18

第四章 讨论 19

4.1 讨论 19

参考文献: 20

致谢 23

第一章 文献综述

1.1 背景

自1928年抗生素被发现并广泛使用于医学领域后，之前由细菌所引起的伤寒，细菌性疟疾以及结核病等难以治疗的感染性疾病均得到了有效控制，人类的平均寿命也因此得以延长。然而，随着抗生素的大量使用，细菌的耐药性亦随之增加，而抗生素滥用，加剧了细菌的耐药性进程，乃至产生超级细菌。

随着进入21世纪之后，细菌耐药现象的急速增加，超级细菌成为全世界关注的焦点^[1]。世界卫生组织报道称，随着抗生素的滥用，全球每年将会有近70万人死亡，如果这个问题不能得到及时解决，世卫组织的专家有预测，到2050年，全世界每年将会有1000万人因为抗生素滥用产生的耐药性死亡。中国的抗生素滥用情况在世界上是比较严重的之一，我国每年抗生素用量接近全球用量一半^[2]。2018年中国细菌耐药性监测结果显示，我国因为抗生素滥用产生的细菌耐药形势比较严峻，临床发现各类细菌对常用抗菌药的耐药率明显提高，其中比较严重的是碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，从2005年到2018年，肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药率从3.0 %上升到了25.0 %，对美罗培南的耐药率从2.9 % 上升到了26.3 %，增幅接近9倍^[3]。细菌耐药性使得人类的健康和生命安全面临新的考验^[4]。因此，人类必须尽快开展新的抗生素研制工作，以治疗由耐药菌引起的复杂疾病。

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