论文总字数：20090字

摘 要

莱鲍迪甙A（Rebaudioside A，RA甙）是由甜菊糖中成分含量高但口感偏苦的甜菊糖甙（Stevioside, St甙）通过糖基转移酶UGT76G1催化合成。拥有热量低，口感好等优点，是一种相对理想，受人青睐的天然甜味剂。本实验通过将蔗糖合成酶Atsus1与糖基转移酶UGT76G1的基因用刚性连接肽（EAAAK)₃连接并插入Ncol/Xhol中，构建融合酶重组基因质粒载体。导入大肠杆菌细胞进行表达。同时探索在大肠杆菌内融合酶系统的优化以及其在生产应用。通过改变粗酶的浓度，底物蔗糖与St甙用量的比例，反应温度以及培养基pH值等条件变化，以提高RA甙的最终产率。实验证明pRSF-Atsus1-R3-76G1的连接方式比pRSF-76G1-R3-Atsus1的更有利于提升RA产率。反应时间4 h所合成RA的最佳优化体系为：温度(T）50℃，St甙与蔗糖浓度比为1：20，粗酶浓度为10 mg/mL，pH为7.2（50 mmol/L磷酸钾缓冲液）最终RA甙的产率为50.97%。

关键词：糖基转移酶UGT76G1 蔗糖合酶Atsus1 莱鲍迪甙A 融合酶系统

Application of enzymatic catalytic synthesis of rebaudioside A

ABSTRACT

Rebaudioside A is due to the high content of stevioside but bitter taste Stevioside, St glycoside is catalyzed by glycosyltransferase UGT76G1. It has the advantages of low calorie and good taste. It is a relatively ideal and popular natural sweetener.In this experiment, the gene of sucrose synthase Atsus1 and glycosyltransferase UGT76G1 was connected with rigid linking peptide（EAAAK)₃and inserted into Ncol / Xhol to construct a recombinant gene plasmid vector of fusion enzyme.Introduced into E. coli cells for expression. At the same time, explore the optimization of the double enzyme system in E. coli and its application in production. Changing the concentration of crude enzyme, reaction temperature (T) ,the pH and the ratio of the amount of substrate sucrose and St glycosides of the medium to improve the final yield of RA glycosides .Experiments show that the connection mode of pRSF-Atsus1-R3-76G1 is more conducive to improving RA yield than pRSF-76G1-R3-Atsus1.The best optimized system of RA synthesized in 4 h reaction is : temperature (T) 50 ℃, St glycoside to sucrose concentration ratio 1:20, crude enzyme concentration 10 mg / mL, PH = 7.2 (50 mmol / L potassium phosphate buffer) , The final yield of RA glycoside was 50.97%.

Keywords: glycosyltransferase UGT76G1; sucrose synthase Atsus1; rebaudioside A; Fusion enzyme system

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文 献 综 述 1

1.1莱鲍迪甙简介 1

1.1.1 甜菊糖 1

1.1.2 RA甙 1

1.2.3 糖基转移酶 2

1.2融合酶法 2

1.2.1融合酶法介绍 2

1.2.2融合酶法主要运用 3

1.3RA甙检测方法 3

1.3.1高效液相色谱法（HPLC） 3

1.3.2薄层色谱法( TLC) 4

1.3.3毛细管电泳（GE） 4

1.4 RA甙酶法合成的研究现状 4

1.5融合酶法催化合成RA甙的前景： 5

1.6 本论文的研究意义 5

第二章 融合酶法催化合成莱鲍迪甙A的应用 6

2.1前言 6

2.2 仪器与材料 6

2.2.1实验仪器 6

2.2.2实验菌株 7

2.2.3实验试剂 8

2.2.4 培养基配方成分 8

2.3 实验方法 9

2.3.1前期准备 9

2.3.2 菌的活化 9

2.3.3发酵罐培养 9

2.3.4 制备粗酶 10

2.3.5测定粗蛋白浓度 10

2.4 HPLC测定莱鲍迪甙A 10

2.4.1 标准曲线的测定 10

2.4.2 样品的制备 11

2.4.3 色谱条件 11

2.5 实验结果与结论 11

2.5.1标准曲线 11

2.5.2大肠杆菌蛋白酶表达情况 12

2.5.3 不同连接方式对融合酶反应体系的影响 13

2.5.4 温度对融合酶系统的影响 14

2.5.5 St甙与蔗糖浓度比例对融合酶系统的影响 15

2.5.6 pH值对融合酶系统的影响 16

2.5.7 酶浓度对融合酶系统的影响 17

第三章 结论与展望 19

3.1主要结论 19

3.2前景展望 19

参考文献 20

致 谢 23

第一章 文 献 综 述

1.1莱鲍迪甙简介

1.1.1 甜菊糖

从甜叶菊叶中提取出的甜菊糖是一种多种糖甙混合的天然甜味剂。其甜度高，但热能较低，没有毒副作用，使用安全，而且具有降血压，降血糖，抗肿瘤等医学药理辅助作用，是一种深受大众喜爱的代糖，甜菊糖的生产令国内外非常重视，被认为是理想的蔗糖替代品^[1]。我国现在已成为世界上生产与出口甜菊糖最大的国家，甜菊糖也慢慢在食品，医药等产业上得到广泛的应用^[2]。图1为甜菊甙分子结构式。

图1-1 甜菊甙分子结构式

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