论文总字数：20743字

摘 要

目前，纳米载体被广泛的应用于肿瘤治疗中药物的递送，且发展日趋稳定。对于治疗肿瘤疾病，其主要的障碍是肿瘤细胞的多重耐药性（MDR）。针对肿瘤细胞的多重耐药性，增强药物载体的通透性和滞留（EPR）效应成为开发实体肿瘤靶向运载药物材料的关键。在这项实验中，我们将利用肽类树状大分子独特的亲水，疏水性能形成带有空洞的胶束以物理包覆的形式携带肿瘤治疗药物阿霉素和金纳米颗粒协同治疗肿瘤。该载体基于由赖氨酸人工合成的肽类树状大分子，阿霉素（DOX）束缚的金纳米颗粒以及长链聚乙二醇（PEG）构成。阿霉素（DOX）和金纳米同为公认治疗癌症的有效药物，两种药物协同治疗肿瘤细胞加上长链聚乙二醇提高生物相容性，预期可以很好的提高治疗效果。通过被动靶向效应利用巨噬细胞吞噬外界异物的自然倾向将高分子载体包裹的药物释放入肿瘤细胞内部。金纳米可以高效的热消融癌细胞，并且促进阿霉素在肿瘤间质中的存留和积累。实验的细节包括：实验组织的培养、AuNPs纳米颗粒的体内外释放和响应性测定、通过透射电子显微镜（TEM）测定肽类树状大分子的半径、细胞摄取评估、NMR谱和HPLC色谱测定纳米颗粒中阿霉素（DOX）的含量、测定由细胞微环境导致的纳米材料尺寸和zeta电位变化、最后观察其对正常细胞的毒性作用做出最终的病理学评估。

关键词 肽类树状大分子 金纳米颗粒(AuNPs) 纳米载体 药物运输 协同治疗Abstract

At present, nanocarriers are widely used in drug delivery in tumor therapy, and the development is becoming more and more stable. The major obstacle to the treatment of tumor diseases is the multiple drug resistance (MDR) of tumor cells. Targeting multiple drug resistance in tumor cells and enhancing drug carrier permeability and retention (EPR) effects are key to the development of targeted drug delivery materials for solid tumors. In this experiment, we will utilize the unique hydrophilic and hydrophobic properties of peptide dendritic macromolecules to form micelles with holes in the form of physical encapsulation to carry the tumor therapeutic drug adriamycin and gold nanoparticles to treat the tumor. The carrier is based on dendritic macromolecules synthesized from lysine, DOX bound gold nanoparticles and long-chain polyethylene glycol (PEG). Doxorubicin (DOX) and gold nanorods are both recognized as effective drugs for the treatment of cancer. Therefore, in this experiment, two drugs cooperate to treat tumor cells together with long-chain peg to improve biocompatibility, which is expected to improve the treatment effect. By passive targeting, the natural tendency of macrophages to engulfing foreign bodies is utilized to release the drug wrapped in a polymer carrier into tumor cells. Gold nanoparticles can effectively heat ablation cancer cells and promote the retention and accumulation of adriamycin in tumor stroma. Experiment include: the details of the organization's culture, the release and in vivo and in vitro response of AuNPs nanoparticles sex determination, peptide by transmission electron microscope (TEM) measurement of the radius of the dendritic macromolecules, cell uptake assessment, NMR spectrum and HPLC chromatographic the content of amidomycin in nanoparticles, the determination by cell microenvironment in nanometer material size and zeta potential change, the observation of its toxic effect on normal cells to make the final pathological assessment.

Keywords: peptide dendritic macromolecule; Gold nanoparticles (AuNPs); collaborate treatment;drug deliver

目 录

摘 要 I

第一章 绪论 1

1.1治疗肿瘤的挑战 1

1.2 肽类树状大分子在肿瘤治疗上的应用 2

1.2.1 肽类树状大分子的简介 2

1.2.2肽类树状大分子的结构 3

1.2.3肽类树状大分子与药物的结合 4

1.2.4 肽类树状聚合物应用于递送药物 5

1.2.5 肽类树状大分子释放药物机理 6

1.3 联合治疗 7

1.3.1 放化疗联合治疗的研究进展 7

1.3.1增敏剂 7

1.3.2金纳米颗粒（AuNps）的作用 8

1.3.3金纳米颗粒阿霉素协同治疗 8

第二章 实验步骤 10

2.1 G1L的合成 10

2.2 G1L-G1L的合成 10

2.3 G1L-G2L的合成 10

2.4 G1L-G3L的合成 11

2.5 PEG化树枝状大分子的合成 11

2.6 DOX的负载 11

2.7 AuNPs的负载 11

第三章 实验结果与讨论 12

3.1 PEG化肽类树状大分子凝胶包覆阿霉素的设计 12

3.2纳米粒子的大小，形态和zeta电位 12

3.3 体外细胞毒性 13

3.4 核磁共振分析 13

第四章 总结 14

参考文献 15

致谢 19

第一章 绪论

1.1治疗肿瘤的挑战

众所周知肿瘤是一种可怕的疾病，肿瘤细胞是机体细胞在外界促进因素的影响下分化、增生变异成的一种新生物。大部分的肿瘤病因是不明确的，这也意味这我们现今的医疗手段无法完全治愈肿瘤。在医学上，治疗癌症的第一手段就是切除肿瘤细胞，但是往往这种手术无法根除肿瘤病灶，因为肿瘤细胞通常与正常的组织错综复杂的缠绕在一起。手术后没有完全切除的肿瘤细胞会导致病情转移或者复发。恶性肿瘤会在体内不受控制的无限增殖，且在增殖过程中会破坏正常的生理组织和人体器官，从而影响整个人体的免疫能力。放射治疗（RT）和化疗使最常见的治疗方法，但是放射治疗对低氧肿瘤很难产生有效的治疗效果，因为低氧肿瘤对电离治疗有抗性。多次化疗会导致耐药性问题并且药物会在正常组织积累会对正常组织产生侵害性。开发纳米载药体系，研究纳米疗法来替代传统化疗降低肿瘤治疗对患者的危害成为了人类抗癌路上的新挑战。目前克服肿瘤细胞的多重耐药性是高分子药物载体需要克服的主要困难。肿瘤血管通常是渗漏的，曲折的，扩张的和不均匀分布的，肿瘤的外围通常血管密度较高，而肿瘤的中心表现出较低的血管密度^[1]，[2]。在动物模型中估计的各种肿瘤中，肿瘤血管壁的孔的大小是异常的，在10nm至2000nm的范围内，这是EPR作用的实际基础^[3]，[4]。然而，扩散中的癌细胞会压缩肿瘤内的血液和淋巴管，这不仅会损害血液流动，还会损害淋巴管流动，从而导致组织液压力（IFP）均匀升高^[5]。另外，在许多肿瘤中，诸如I型和III型^[6]，[7]在间质基质中纤维状胶原的积累增加。总体来说，间隙空间中升高的IFP和纤维状胶原促成肿瘤微环境的异质性，这可能会阻碍穿过肿瘤血管壁后穿过间隙基质的扩散，特别是对于较大尺寸的纳米载体。纳米载药体系的尺寸在肿瘤微环境中对其递送药物的能力有着非常大的影响，较大尺寸的纳米材料会拥有较长的血液半衰期，小颗粒的纳米材料不仅血液半衰期较短，而且有进入正常组织的风险，但是与大颗粒相比小颗粒的纳米载药体系拥有更高的穿透效率。综上所述，在纳米载体进入肿瘤间质之前其尺寸应较大，这样才可以设计出更高效无害的载药体系。因此对于由于尺寸的大小导致的渗透性和保留率的矛盾，发展尺寸可收缩的纳米载药体系成为最有效的解决手段，所谓尺寸可收缩纳米载体就是纳米载体可以在肿瘤微环境的刺激下改变其尺寸。此外药物在肿瘤微环境的释放是另一个需要克服的困难，化疗药物运送到肿瘤的机理与正常组织不同。肿瘤细胞的特殊结构使其拥有多重耐药性，原因在于肿瘤细胞有细胞质膜，质膜上的糖蛋白（P-gp）是膜结合活性药物外排泵，这种蛋白是一种活性转运蛋白可以排出多种结构和功能独特的抗癌药物。为了克服肿瘤细胞的多重抗药性，我们需要抑制这种糖蛋白的活性，使其无法外排药物，以提高药物进入肿瘤细胞的效率。抑制这种糖蛋白（P-gp）就需要功能性的树状大分子，将纳米树状大分子进行特殊的编码，靶向编码 P-gp的siRNA会传递到MDR细胞中减弱P-gp的表达使细胞内药物水平恢复至诱导细胞毒性所需的浓度从而得到可以抑制MDR细胞生长效率的细胞毒性药物。此外为了实现药物的可控释放，已经开发了几种策略来设计具有刺激敏感性的纳米颗粒。刺激敏感的药物递送系统的构建基于肿瘤微环境的异常，例如酸性pH，氧化还原电位改变或酶的上调^{[8]，[9]，[10]}。这些肿瘤内部条件可用于控制纳米治疗剂的行为，从而导致肿瘤特异性药物释放。

1.2 肽类树状大分子在肿瘤治疗上的应用

1.2.1 肽类树状大分子的简介

开展对于肽类树状大分子的研究现在已经成为癌症化疗药物的载体开发设计中的重要组成部分之一。从聚合物的角度来看，树状大分子可以与药物形成具有响应能力的结合物。肽类树状大分子可以长期为被包埋药物提供贮存的场所并且可以使药物的释放能力增强，从而成为了比较有潜力的治疗方。氨基酸的低聚物就是肽，其广泛的应用于生活中特别是在医学和医药领域主要作为治疗剂。树状大分子是一类新型的人工合成高分子材料，树状大分子呈现球状或椭圆状结构，它由中心内核、重复的分支和表面官能团构成^[11]，它的分子结构高度支化具有三维结构且有纳米级尺寸等特点^[12，13]，此外其结构可以通过实验手段精确控制，使其内部带有疏水空间并且其表层结构具有亲水性特性^[14，15]。此外，连接带有光物理或光化学活性的官能团可以使其生成带有光功能的树状聚合物^[16]，[17]。与线性肽相比分支和超支化的肽类树状聚合物其肽的稳定性和功能性更好，其能够与治疗剂更好的缀和或者复合或者更好的包覆治疗剂，且可以截留治疗剂因为其表面具有柔性且具有超支化的结构。肽类树状大分子也不是没有任何缺点，其表面电荷处于高电荷状态，这就导致了作为治疗剂载体材料时，表面上的游离氨基会导致毒性反应，从而限制了它的使用，这种限制可以通过聚乙二醇化来克服，聚乙二醇（PEG）可以乙酰化其表面氨基。正是因为肽类树状大分子具有良好的尺寸以及结构的可设计性，使其在医学上和制药学上都被普遍的认可了。

1.2.2肽类树状大分子的结构

氨基酸或小肽结构单元可以聚合成肽类树状大分子，也就是说肽类树状大分子是结构中含有肽键的树状大分子。肽类树状大分子的结构是类球蛋白的，这种结构赋予其良好的水溶性和生物相容性等特点，使其可以高效的通过肿瘤细胞质膜进入肿瘤间质中。肽类树状大分子作为药物递送系统能够降低药物不良反应，提高治疗指数，具有增溶、增效、缓释、控释的功能，因此，其拥有巨大的医疗潜力。肽类树状大分子中带电氨基酸的位置、数量和结构性质由氨基酸所决定。肽类树状大分子因为其荷电残基的含量高导致其拥有较好的结构可控性。可以通过调节其分子结构中荷电残基的含量来控制肽类树状大分子的结构刚度。目前用于合成肽类树状大分子的最普遍的聚合物核之一是聚酰氨基（PAMAM）核（图1）。

请支付后下载全文，论文总字数：20743字