论文总字数：20115字

摘 要

单细胞酵母交配过程中的融合事件是细胞间融合的典型研究对象。在酿酒酵母中，Prm1是已知的与交配过程质膜融合步骤有关的少数蛋白质之一。Prm1缺失突变体交配对在融合过程中表现出系列障碍表型，表明Prm1蛋白可能在融合事件中起到重要作用。但目前未见对Prm1表达纯化的研究，考虑到其二聚体结构，且是四次跨膜蛋白，其表达纯化对于研究其特性具有重要意义。

本研究以E.coli BL21为宿主细胞，选择外泌型原核表达载体pET22b( )，尝试对Prm1的理化性质进行表征。结果显示，在全细胞裂解液上清中出现Prm1条带。后续将从诱导时间、温度等几个方面进一步优化发酵条件，提高Prm1产量。本课题对研究Prm1的结构具有重要意义，为进一步揭示Prm1在细胞融合中的具体作用机制奠定基础。

关键词：细胞融合 Prm1 异源表达 Prm1-pET22b

Construction and Expression of the Expression Vector of Prm1-pET22b E coli

Abstract

The fusion event in the mating process of haploid yeast is a typical model for research on cell-cell fusion. Prm1 is one of the few proteins known to be related to the plasma membrane fusion step of the mating process in Saccharomyces cerevisiae. Series of obstacle phenotypes during the fusion of △Prm1 mutants indicate that Prm1 plays an important role in the fusion event. However, no study related to the expression and purification of Prm1 have been conducted. Considering that it has four putative transmembrane domains and functions as a disulfide-linked complex, the expression and purification of Prm1 are of great significance for the further study on its characteristics.

In this study, the prokaryotic expression vector pET22b( ) was selected to express in E. coli BL21, trying to characterize the physical and chemical properties of Prm1. The SDS-PAGE results showed that corresponding band of Prm1 appeared in the supernatant of whole cell lysate. Next, the fermentation conditions will be further optimized in induction time and temperature to enhance the production of Prm1. This study is of great significance for research on the structure of Prm1, and lays the foundation for revealing the specific mechanism of Prm1 in yeast cell fusion.

Key words: Cell fusion; Prm1; Heterologous expression; Prm1-pET22b

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 细胞融合 1

1.1.1 酿酒酵母中的细胞融合 2

1.1.2 成肌细胞的融合 2

1.2 细胞融合的途径 3

1.2.1 细胞融合的影响因素 3

1.2.2 细胞融合的关键蛋白Prm1 4

1.2.3 Prm1的作用机制 4

第二章 实验材料 6

2.1 菌株与质粒 6

2.2 主要实验试剂 6

2.3 主要实验仪器 7

第三章 实验方法 9

3.1 生物信息学方法 9

3.2 主要溶液成分与培养基 9

3.2.1 1 %琼脂糖凝胶的配制 9

3.2.2 TAE核酸电泳缓冲液 9

3.2.3 LB液体培养基 9

3.2.4 LB氨苄固体培养基 10

3.2.5 LB固体培养基 10

3.2.6 胶的配制 10

3.2.7 LB葡萄糖培养基 10

3.3 表达载体构建试验方法 11

3.3.1制备1 %琼脂糖凝胶 11

3.3.2 单菌落接种到液体培养基 11

3.3.3 质粒pET22b转化E.coli DH5α 12

3.3.4 质粒pET22b的提取 12

3.3.5 凝胶电泳验证质粒pET22b 13

3.3.6 酵母BY4741基因组的提取: 13

3.3.7 prm1基因PCR获取与扩增 14

3.3.8 凝胶电泳PCR产物 15

3.3.9 重组质粒prm1-pET22b的构建与验证 15

3.3.10 PCR验证构建重组质粒Prm1-pET22b 16

3.3.11 凝胶电泳验证Prm1-pET22b的PCR产物 17

3.3.12 提质粒并测序 17

3.4 表达载体表达试验方法 18

3.4.1 Prm1-pET22b转化到E. coli BL21 18

3.4.2诱导表达 19

3.4.3 超声破壁 19

3.4.4 配制SDS-PAGE胶 19

3.4.5 蛋白质电泳 20

第四章 结果分析 21

4.1生物信息学分析质粒 21

4.2 结果分析 26

4.2.1 Prm1扩增温度测定 26

4.2.2 Prm1 47 ℃扩增温度验证 27

4.2.3 纯化Prm1基因验证和Sal I线性化质粒 27

4.2.4 E.coli BL21（pET22b-Prm1）转化子双酶切验证 29

4.2.5 E.coli BL21（pET22b-Prm1）质粒验证 29

4.2.6 Prm1-pET22b蛋白质表达的凝胶电泳 30

第五章 结论与展望 32

参考文献 33

致谢 35

第一章 文献综述

背景

细胞融合在当今时代被广泛研究，应用广泛，是细胞工程的重中之重。因此研究细胞融合意义深远。

1.1 细胞融合

细胞融合发生在受精发育的整个过程之中。在病毒感染和细胞融合的背景下，膜融合被广泛研究。目前的研究大多认为，膜融合是由介导膜融合的蛋白质，即融合酶介导的。研究最深入的融合酶是SNARE，它介导细胞内细胞器和囊泡的融合^[1]。细胞融合对于多细胞生物的发育至关重要。某些细胞融合过程仅涉及一对细胞，如精卵细胞的融合；许多发育过程需要多次融合，如成肌细胞融合形成肌肉。但是，所有融合事件都必须克服一个共同的障碍：在融合两个磷脂双层的疏水核心的同时，要保持两个质膜的完整性、选择透过性和渗透性。现有研究表明，融合酶通过直接接触脂质双分子层，催化高能融合中间体的形成，推动状态转变，进而促进融合。融合本身包括脂质双分子层连续性的局部断裂和重新连接。应用不同理论和试验方法，通过对细胞融合机制和途径的研究，得出了以下几个重要的结论：在融合前，相对的质膜之间存在一个由特定的细胞—细胞粘附蛋白控制的稳定间隔，范围是十纳米到几十纳米不等。双分子层相互靠近需要膜蛋白向融合位点的边缘移动，并且在约2 nm的距离上克服水化力或者热波动相关的非常强的排斥作用。单侧膜或对侧膜的扭曲、变形使相对的质膜发生直接接触，并促进脂质单分子层之间的局部破坏和重新排列。许多融合过程开始于两个质膜的外层单分子层的融合，单分子层的合并使膜之间的脂质混合进而产生初期的融合孔，让细胞内的物质混合。在生物体内的融合过程中，蛋白质可能是早期融合中间体的关键结构成分。融合蛋白介导两个细胞质膜融合的。如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一，有介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。目前已发现的与细胞融合相关分子有树突状细胞-特异性跨膜蛋白、OC质子泵亚单位、信号转导及转录激活因子、CD47、CD44、CD9、CD81等^[2-11]。

1.1.1 酿酒酵母中的细胞融合

酿酒酵母作为一种简单的单细胞真核生物，遗传背景清晰，分子操作手段成熟，是研究细胞融合机制的理想模型。酵母中的交配途径包括5个步骤：信息素信号传导，粘附，细胞壁的降解，质膜融合和核配。酿酒酵母具有两种单倍体交配类型：MAT a和MAT α^[12]。单倍体细胞分泌信息素，该信息素与相反交配型细胞表面的G蛋白偶联受体结合，激活信号传导级联反应，导致细胞周期停滞、信息素诱导型基因的表达以及细胞的极化生长，从而形成shmoo凸起，其末端的互补凝集素介导相对交配类型的两个细胞结合形成一个交配对^[13]。然后，两个细胞壁接合在一起，以形成保护配对的统一壁，并且两个细胞接触位点之间的细胞壁退化，这使质膜接触并融合，细胞之间的初始融合孔扩大，以使细胞质混合，并最终完成核融合。交配完成后，有丝分裂恢复，二倍体子代细胞从连接两个亲本细胞的颈部出芽^[14]。

1.1.2 成肌细胞的融合

成肌细胞融合是动态过程，受到高度调控。主要过程是细胞骨架重排和细胞膜上形成融合孔，然后进行细胞质成分，最终完成细胞融合。许多调控因子参与了细胞融合，如MRFs家族。该家族可以与E-box元件结合，调控大多数成肌相关基因的转录。Myf5和MyoD被认为是关键。而MyoG和Myf4在分化后期高度表达，触发成肌细胞的融合，最终形成肌管。部分细胞粘附蛋白参与了成肌细胞融合过程，如Myoferlin是一种在融合细胞膜上高表达的跨膜蛋白，该蛋白由6个C2结构域和一个羧基端跨膜域构成，依赖于钙离子和磷脂结合^[15]。

1.2 细胞融合的途径

图1

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