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摘 要

裂殖壶菌通常生活在40~100%海水的盐度，50~200%海水的盐度也不会影响其生长。其耐盐特性使得其被广泛应用于含盐废水处理中。此外，作为中度耐盐微生物，它也是研究胁迫应对机制的一个宝贵资源，发现的基因靶点，可能为其他微生物产生耐盐特性提供一些可能。

在以往关于裂殖壶菌的研究中，研究人员主要以提高其生产DHA能力为目的，从发酵以及基因工程角度来研究裂殖壶菌，但关于其是如何调节耐盐机制网络赋予其一定耐盐性能的还知之甚少。在本实验中，我们以真菌中重要的信号通路之一丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)级联途为切入点，同时将MAPK在酿酒酵母中进行过表达，模拟外界常见环境胁迫因素，观察酿酒酵母的生长情况，抗逆性，细胞完整性等，初步验证MAPK是否具有抵抗环境胁迫的能力。具体研究结果如下：

关键词：裂殖壶菌 转录组分析 高盐胁迫 丝裂原激活蛋白激酶 酿酒酵母

Abstract

Schizochytrium sp is more and more concerned because it can produce more than 50% lipid rich in docosahexaenoic acid (DHA,22：6). and it usually lives at the salinity of 40~100% seawater, and the salinity of 50~200% seawater does not affect its growth. Its salt-tolerant characteristics make it widely used in salt-containing wastewater treatment. in addition, as a moderately salt-tolerant microorganism, it is also a valuable resource for studying stress coping mechanisms, and the identified gene targets may provide some possibilities for other microorganisms to produce salt-tolerant properties.Among the previous studies on schizochytrium, researchers mainly aimed at improving their production DHA capacity, transcriptome data to screen out two MAPK,Mpk6315 and Mpk2022, them for conserved domain analysis, protein sequence alignment, and evolutionary tree construction. At the same time MAPK overexpressed in Saccharomyces cerevisiae, simulated common external environmental stress factors, observed Saccharomyces cerevisiae growth, stress resistance, cell integrity, etc., and preliminarily verified whether MAPK had the ability to resist environmental stress.

Keywords: Transcriptional、analysis of high-salt stress 、 mitogen-activated 、protein kinase 、Saccharomyces cerevisiae

目录

第一章 文献综述 2

1.1裂殖壶菌MAPK的简介 2

1.2 耐盐微生物的简介 2

1.3分裂原活化蛋白激酶与细胞信号转导 3

1.3.1MAPK的结构 3

1.3.2酿酒细胞MAPK级联途径功能 4

1.4总概述 6

第二章 实验材料和设备 7

2.1实验材料 7

2.1.1实验仪器 7

2.1.2实验试剂 7

2.1.3实验室所用菌株、质粒、引物 9

2.2培养基、缓冲溶液 9

第三章实验方法 11

3.1Mpk2022和Mpk6315在酿酒酵母中的过表达 11

3.1.1裂殖壶菌基因组提取 11

3.1.2 Mpk2022以及Mpk6315蛋白序列的获得 11

3.1.3 pESC-Mpk2022 真核表达载体的构建 12

3.1.4 YPH499酿酒酵母感受态的制备 12

3.1.5 酿酒酵母电转 13

3.1.6 筛选转化子 13

3.1.7 Mpk宿主的诱导表达 13

3.1.8生长曲线测定 13

3.1.9 菌落抗逆性分析 13

3.2 相关分子生物学实验方法 14

3.2.1质粒提取与胶回收 14

3.2.2 琼脂糖凝胶电泳 14

3.2.3 大肠杆菌化学转化方法 14

第四章结果与讨论 15

4.1构建pESC-Mpk2022 和pESC-Mpk6315真核表达载体 17

4.2 重组质粒pESC- Mpk2022和pESC-Mpk6315酵母转化及阳性菌株的筛选 17

4.3过表达MAPK基因酿酒酵母生长状况分析 18

4.4MAPK的NaCl胁迫抗性分析 18

4.5MAPK的高浓度乙醇胁迫分析 19

4.6 MAPK的高温胁迫分析 21

第五章结论与展望 24

5.1结论 24

5.2展望 24

参考文献 27

致谢 31

第一章 文献综述

1.1裂殖壶菌MAPK的简介

裂殖壶菌是一种海洋真菌，分类学上属于囊泡藻界，不等鞭毛门，卵菌纲，破囊壶菌科，裂殖壶菌属。其细胞在增殖过程中不易分开，呈现出一种花苞形态，形成多细胞聚集。其油脂含量占细胞干重可达到77%，总脂肪酸中DHA含量高达40%-60%，具有生长速度快、发酵周期短、多不饱和脂肪酸含量高等特点^[1-2]，而被认定为是潜在的商业化生产DHA的优良菌株。

MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。

1.2 耐盐微生物的简介

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