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摘 要

近年来，市面上出现的防老抗老的产品日益增加，受到广大女性同胞的关注。2019年雅诗兰黛凭借其优秀的抗氧化修复能力火爆美妆市场，其重要成分麦角硫因的显著的抗氧化作用使得雅诗兰黛小棕瓶火爆全球。麦角硫因在1909年首次在一种真菌中发现，分布于谷类植物，许多微生物和真菌中，可以通过化学合成、提取法合成和发酵法合成。麦角硫因具有良好的光热酸碱稳定性，可以在化妆品中用来抗老，能有效清除-OH，强效清除次氯酸，还能避免红细胞受到中性粒细胞的危害，此外，麦角硫因还可以起到抗炎作用，在各领域都具有广泛的前景和用途。因此我们更要研究麦角硫因。使其发挥其优良特性，实现低成本产出，这不仅是学术上的研究，还是科学技术的进步，更是为民众谋取福利。

本论文以麦角硫因真菌合成途径中酶egt1为研究对象，初步分析了其理化性质和功能鉴定，并在大肠杆菌体内表达了来自糙皮侧耳中egt1酶。在实验前，要做好准备工作：确立纯化的目标及纯度要求，获取目标蛋白的基本新希望，建立纯化过程的检测方法，对麦角硫因egt1酶进行提取分离纯化，对麦角硫因egt1酶进行理化性质和分子量的分析。主要的实验内容和结果如下：

本实验在培养基中加入一定浓度的卡那霉素，使大肠杆菌细胞内转入了相应抗性的质粒，抗性基因作为质粒上的筛选标记，诱导大肠杆菌后进行镍柱亲和层析法洗脱蛋白，而后进行SDS-page电泳得到蛋白带。实验最终得到egt1酶的分子质量，并对其理化性质等多种性质进行分析。对egt1蛋白进行一级结构分析，由数据分析得到egt1为脂溶性亲水蛋白；通过SignalP对egt1信号肽进行分析，根据分值与蛋白质的疏水性呈负相关，分析出该蛋白为非分泌性蛋白；通过结构域预测，NCBI分析该蛋白含有两个结构域，位置分别在36-350aa，373-860aa；在进化树构建中，分析得知其氨基酸序列存在较多的保守序列，4-二甲基烯丙基色氨酸N-甲基转移酶与Neurospora crassa egt1有最近的亲属关系；本实验中还表达了来自糙皮侧耳的egt1基因，以大肠杆菌为宿主，优化原始序列之后，构建带有His标签的表达载体，并成功在15℃下诱导并表达出可溶性蛋白。通过对优化序列进行网上理化性质分析，推算出来此蛋白分子量为96.86KDa，根据蛋白maker确定目标蛋白已表达出来。

关键词：egt1 异源表达 生物信息学 egt1功能域

Functional identification and expression of enzyme egt1 in the synthetic pathway of ergothione fungi

ABSTRACT

In recent years, there are more and more anti-aging products on the market, which have attracted the attention of everbright women. In 2019, estee lauder became popular in the beauty market with its excellent antioxidant repair ability. The significant antioxidant effect of its important ingredient ergosulfurin made estee lauder small brown bottle popular around the world. Ergot thionein was first discovered in 1909 in a fungus, found in cereal plants, and in many microorganisms and fungi. It can be synthesized by chemical synthesis, extraction synthesis, and fermentation. Ergot sulfur because it has good heat, acid and alkali stability, can be used for anti-aging in cosmetics, can effectively remove - OH, powerful hypochlorous acid, also can protect the red blood cells from the dangers of neutrophils, inhibit peroxynitrite anion mediated amino acid oxidation to have anti-inflammatory effect, ergot sulfur because these features determines its in medicine, food and beverage, functional food, cosmetics and biotechnology, and other fields have a wide range of USES and market prospects, so we should study it more, make it play its excellent features, to implement low cost production, this is not only the academic research, and the progress of science and technology, But also for the welfare of the people.

In this paper, the functional identification and expression domain of the enzyme egt1 in the synthesis pathway of ergothionein fungi were taken as the research object. preliminary analysis of their physicochemical properties and functional identification and expression of enzymes from the pellagma lateral ear in egt1 e. coli. Prior to the experiment, preparations should be made to establish the target and purity requirements of purification, obtain the basic new hope of target protein, and establish the detection method of purification process. At the same time, based on the existing tools and the separation and purification of proteins, which is the basis of protein function research, the ergothionein egt1 enzyme was extracted, isolated and purified, and the physical and chemical properties and molecular weight of the ergothionein egt1 enzyme were analyzed. The main contents and results are as follows: the experiment, add a certain concentration in culture medium of card that make the e. coli cells into the corresponding resistance plasmid, resistance genes as selection markers on the plasmid, performed after the induction of e. coli nickel column affinity chromatography elution proteins, and then to get proteins with sds-page electrophoresis. The correlation curves were obtained to calculate the molecular weight of egt1 enzyme.

Finally, the molecular weight of egt1 enzyme was obtained, and its physical and chemical properties, hydrophobicity and other properties were analyzed. The primary structure of the protein was analyzed by using Prot Param, and egt1 was found to be a fat-soluble hydrophilic protein. SignalP was used to analyze the egt1 signal peptide. According to the negative correlation between the signal peptide score and the hydrophobicity of the protein, the protein was identified as a non-secretory protein. By domain prediction, NCBI analyzed that the protein contained two domains at 36-350aa and 373-860aa, respectively. In the construction of the evolutio nary tree, the analysis showed that there were many conserved amino acid sequences in the amino acid sequence, and the 4-dimethylallyl tryptophan n-methyltransferase was closely related to egt1 in Neurospora crassa. this experiment also expressed the egt1 gene from the pellagma lateral ear. after optimizing the original sequence, the expression vector with His label was constructed and the soluble protein was successfully induced and expressed at 15℃ base on the previous  experimental data, the correlation curve was obtained to calculate the molecular weight of egt1 enzyme (96.86kDa).

Key words: egt1 heterologous expression bioinformatics egt1 functional domains

目 录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅲ

第一章 研究背景 1

1.1麦角硫因的基本概述 1

1.1. 1麦角硫因的应用 1

1.1. 2麦角硫因的基本简介 2

1.1. 3麦角硫因的分布及其代谢 2

1.1. 4麦角硫因的功能 3

1.2麦角硫因合成途径 5

1.2. 1化学合成法 5

1.2. 2提取合成法 5

1.2. 3发酵合成法 5

1.3研究麦角硫因合成的意义 6

第二章 麦角硫因合成途径中egt1功能的初步鉴定及表达 7

2.1引言 7

2.2准备工作 7

2.3实验依据 8

2.3. 1egt1酶分离纯化步骤 8

2.3. 2细胞破碎 8

2.3. 3镍柱分离层析 8

2.4实验步骤与方法 8

2.4. 1提取麦角硫因egt1酶 8

2.4. 2实验注意事项 9

2.5结果与讨论 9

2.5. 1蛋白质基本性质分析 9

2.5. 2 egt1酶理化性质分析 15

2.5. 3疏水性和信号肽分析 16

2.5. 4结构域预测 17

2. 5. 5 egt1保守位点预测以及进化树分析 18

2. 5. 6 egt1的异源表达 19

2.6本章小结 19

第三章 结论与展望 20

3.1结论 20

3.2展望 21

致 谢 22

参考文献 23

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