全文总字数：7002字

1. 1. 毕业设计（论文）的内容、要求、设计方案、规划等

一、前言

要求综述林木多次开花现象物候期观测、形态生理指标以及分子调控机制的最新进展，说明本项研究的内容、目标及意义。

二、方案拟定

1、常春二乔玉兰成花及开花形态与物候观察

1.1常春二乔玉兰花芽生长发育形态观察

1.1.1 营养生长发育观察

以南京林业大学地球仪广场西北侧花园中的常春二乔玉兰为主要研究对象，并于每年3月分别于树冠的东-南-西三个方位随机选取生长状态良好的120枚芽。

于标记芽的苞片开裂（新芽萌动）之日起，定期对所标记芽的长度、宽度进行测量，新芽抽枝长叶后，对观测枝的枝长、叶片数量、顶芽长、顶芽宽、顶芽长宽比及顶芽和树冠的生长情况进行观测，并固定选取8个观测枝在每次观测完毕后进行定向拍照。

每隔3-5d对观测芽（枝）的各项形态指标进行观测，并根据所记录的数据和形态特征，确记录新芽萌动、新叶萌动、新叶开展、新枝快速生长、新枝滞缓生长的时期，并如表1记录：

表1 常春二乔玉兰营养生长情况观测

通过对观测枝营养生长节律的观察，掌握常春二乔玉兰由营养生长想生殖生长转变的关键转折期。

1.1.2花芽分化生长发育形态观察

自新枝滞缓生长期开始，每隔3天对观测枝各项形态指标进行观测，每次观测后选取2-3枚与观测枝生长状态相对一致的非观测枝上的顶芽，用冰盒带回实验室，测量所采样品芽的长度、宽度、重量，并拍照，随后以70% FAA固定液（70% 乙醇：冰乙酸：甲醛=90:5:5，v/v/v）固定后在体式显微镜下进行解剖，观察顶芽的发育状态，获取图像信息，并测量生长锥在各分化发育阶段的长度、宽度。以生长锥由锥形变为圆形为营养生长向生殖生长转变的标志，并通过后续定期观察，从而确定花芽分化的各个时期。

通过对花芽分化生长发育形态的观察，确定花芽分化各个时期，并如表2记录：

表2 常春二乔玉兰花芽分化情况观测

通过对花芽分化生长发育形态观察及各形态指标的观测，说明花芽发育与花器官分化及其与观测枝外部形态的物候相关性，同时界定花芽生长发育关键时期并进行样品的采集。

1.2常春二乔玉兰开花生长发育节律监测

1.2.1常春二乔玉兰初次开花与花后生长发育节律

（1）自休眠期始，对观测枝持续定期观测，以花芽的长、宽数值出现明显变化的时间为初次开花临界期，并每隔3-5d对观测枝的花芽长度和宽度及开花情况进行监测。监测内容如表3记录：

表3常春二乔玉兰初次开花节律监测

（2）在常春二乔玉兰初次开花过程中，随即采取观测枝外的5朵花，并如表4对各花器官发育状态进行监测：

表4常春二乔玉兰初次开花花部器官形态指标

（3）初次开花落败后，每隔5-7d对观测枝上的聚合蓇葖果的长度与宽度进行观测，记录不同时间的落果数量和果实发育情况，并于果熟期统计成熟果实的数量。

1.2.2常春二乔玉兰二次开花及花后的生长发育节律

（1）自观测枝顶芽开始膨大时始，对观测枝持续定期观测，并以部分花芽的长、宽数值相对其他滞缓生长的花芽出现明显变化的时间为二次开花临界期，并每隔3-5d对观测枝的花芽长度和宽度及开花情况进行监测。监测内容如表5记录：

表5常春二乔玉兰二次开花节律监测

（2）在常春二乔玉兰二次开花过程中，随机采取观测枝外的5朵花，并如表4对各花器官发育状态进行监测。

（3）自二次开花结束后，每隔5-7d对观测枝的各项指标进行物候观测，确定并记录落叶期及其后观测枝的生长变化并以三次以上观测数据无明显变化的观测时间作为常春二乔玉兰的休眠期。

通过对常春二乔玉兰两次开花生长发育节律的监测，掌握其开花前后的物候特性，同时界定开花生长发育节律的关键时期并进行样品的采集。

2、常春二乔玉兰成花及开花的生理特征

l 实验样品的选择及处理

根据物候观测所观察和记录的形态指标，分别于常春二乔玉兰的新叶展叶期、新枝快速生长期、生理分化期、花被片原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期、花芽发育期、二次开花初花期、二次开花盛花期、二次开花落败期、二次花后生长期、落叶期、花芽萌动期、初次开花初花期、初次开花盛花期、初次开花落败期进行采样，每次随机采取3个生长状态良好、没有病虫害的枝条，用冰盒带回实验室，清水洗净后，分别取其第二节和第三节的叶片、茎段及其顶芽，分别量取三者的长度、宽度、重量，随后将叶片和茎段剪碎，混匀后，以叶片0.2克一包、茎段0.5克一包分别称量后，放于-75℃超低温冰箱冻存，用于后含物和内源激素含量的测定。

另取常春二乔玉兰生理分化期、花被片原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期、花芽发育期的花芽样品，每次随机采取6枚花芽，用于内源激素免疫组化分析。

2.1常春二乔玉兰成花与开花不同时期内含物的变化动态

2.1.1常春二乔玉兰花器官发育不同时期核酸含量的变化

参照朱广廉等的方法，总核酸含量测定采取紫外吸收法，DNA含量采取二苯胺法^[261]。

2.1.2常春二乔玉兰花器官发育不同时期可溶性糖含量变化

参照李合生方法，采用蒽酮比色法^[262]。

取0.2克叶片样品于试管中，加入10ml蒸馏水，放入水浴锅中沸水浴15min，冷却后将上清液移入25ml容量瓶中，与试管中再加入10ml蒸馏水，再放入水浴锅中沸水浴15min，冷却后再次将上清液移入25ml容量瓶中，用蒸馏水定容至25ml，混匀后即为样品可溶性糖提取液。每时期的样品测定重复三次。

称取1克蒽酮于烧杯中，加入乙酸乙酯，于超声清洗仪中，加入少量热水，震荡促溶，蒽酮试剂全部溶解后以乙酸乙酯定容至50ml，配成2%的蒽酮试剂，整个配制过程须避光。

于干净试管中分别加入1.5ml蒸馏水、0.5ml样品可溶性糖提取液、1.5ml蒽酮试剂、5ml浓硫酸，空白管以0.5ml蒸馏水代替样品液，震荡混匀后，于沸水浴中保温1min，冷却后，用分光光度仪于630nm波长下测量吸光度。

根据标线计算可溶性糖含量，再由以下公式计算样品中可溶性糖的含量：

C：由标准曲线查得的糖含量，μg

V_l：吸取样品液的体积，ml

V_t：提取液总体积，ml

W：样品重量，g

n：稀释倍数

2.1.3常春二乔玉兰发育不同时期可溶性淀粉含量的测定

参照张治安等的方法，采用酸解法和蒽酮比色法^[263]。

将可溶性糖提取后所剩的残渣移入10ml离心管中，加入3ml蒸馏水，沸水浴糊化15min，取出后加入2ml 9.2M的高氯酸，震荡摇匀，然后加热酸解15min，取出后加蒸馏水至10ml，冷却后5000r/min离心10min，上清液移入25ml容量瓶，随后在残渣中再加入2ml 9.2M高氯酸，震荡摇匀，然后再加热酸解15min，取出后加蒸馏水至10ml，冷却后8000r/min离心10min，上清液移入25ml容量瓶，以蒸馏水定容、混匀。每时期的样品测定重复三次。

称取1克蒽酮于烧杯中，加入乙酸乙酯，于超声清洗仪中，加入少量热水，震荡促溶，蒽酮试剂全部溶解后以乙酸乙酯定容至50ml，配成2%的蒽酮试剂，整个配制过程须避光。

于干净试管中分别加入1.5ml蒸馏水、0.5ml样品可溶性糖提取液、1.5ml蒽酮试剂、5ml浓硫酸，空白管以0.5ml蒸馏水代替样品液，震荡混匀后，于沸水浴中保温1min，冷却后，用分光光度仪于630nm波长下测量吸光度。

根据标线计算可溶性淀粉含量，再由以下公式计算样品中可溶性淀粉的含量：

C：由标准曲线查得的糖含量，μg

V_l：吸取样品液的体积，ml

V_t：提取液总体积，ml

W：样品重量，g

n：稀释倍数

2.1.4常春二乔玉兰花器官发育不同时期可溶性蛋白含量测定

参照李合生的方法，采用考马斯亮蓝G-250法^[264]。

取0.2克叶片样品加入研钵，加入少许石英砂，并以3ml pH7.8的PBS研磨成匀浆，而后将研磨液移入10ml离心管中，并以2ml pH7.8的PBS冲洗研钵2次，一起移入离心管，在以pH7.8的PBS加至8ml刻度线，8000r/min离心10min。每时期的样品测定重复三次。

分别取样品蛋白提取液1ml、考马斯亮蓝5ml于干净试管中，震荡摇匀后静置反应2-5min，空白样以1ml pH7.8的PBS代替。

用分光光度仪于595nm波长下测定吸光度。根据标线计算可溶性蛋白含量，再由以下公式计算样品中可溶性蛋白的含量：

C：由标准曲线查得的可溶性蛋白量，

V_t：提取液总体积，ml

W：样品重量，g

V_s：测定时加的样品量，ml

2.1.5常春二乔玉兰发育不同时期淀粉酶含量的测定

参照李合生方法，测定并计算α和β淀粉酶活性^[265]。

2.2常春二乔玉兰成花与开花不同时期内源激素含量动态变化

选取常春二乔玉兰新叶展叶期、新枝快速生长期、花芽分化期、花芽发育期、二次开花初花期、二次开花盛花期、二次开花落败期、二次花后生长期、落叶期、花芽萌动期、初次开花初花期、初次开花盛花期、初次开花落败期的茎段样品，每个时期选三份样品，作为三次重复。将样品用干冰寄送至中国农业大学，分别测定样品中内源IAA、GA、ZR、ABA的含量。

三、实验数据的采集于处理

测定数据经excel2010和SPSS20.0处理，制成折线图，并进行显著性差异和多重比较分析。

四、结果分析简单明确，推论严谨，附表遵循南京林业大学本科毕业设计的论文的格式完成。

2. 参考文献（不低于12篇）

[1] burle i, dean c. the timing of developmental transitions in plants.[j]. cell, 2006,125(4):655-664.

[2] colasanti j, coneva v. mechanisms of floral induction in grasses: something borrowed, something new[j]. plant physiology, 2009,149(1):56-62.

[3] 孙昌辉, 邓晓建, 方军, 等. 高等植物开花诱导研究进展[j]. 遗传, 2007(10):1182-1190.