论文总字数：21856字

摘 要

天然酶在人类的生命活动中扮演着非常重要的角色。但由于其固有的一些缺陷，如成本高、制备难、存储环境苛刻等，其应用受到了一定的限制。为了克服天然酶的这些缺陷，过去的几十年来，人们在寻找天然酶模拟物的方向上做出了许多努力，发现一些纳米尺度的无机材料在特定的外界条件下表现出了与天然酶相似的催化活性。迄今为止，数百种可以模拟过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等活性的纳米材料已经被开发，并基于此构建了一系列生物传感器，应用到了医疗、环境保护等生活中的多个方面。但是其中主流的过氧化物酶模拟物通常需要额外的H₂O₂作为氧化剂催化比色底物或荧光底物的氧化反应，而较高剂量的H₂O₂对生物体系具有一定的危害，因此进一步开发可直接催化氧化底物的氧化酶模拟物并将其应用到实际生活中是很有意义的。

本论文的工作主要包括具有二维结构的Fe@C纳米片（NSs）的合成与表征、考察Fe@C NSs氧化酶活性和优化反应条件。实验结果表明40 μg·mL^-1的Fe@C NSs，在pH值为3.5，温度为40 ℃时反应50 min，催化0.2 mM的比色底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）可展现出其最优的氧化酶活性。此外，本论文希望利用Fe@C NSs的氧化酶活性开发出可实现定量分析生活活性物质的新型高效生物传感器。

关键词：纳米酶 纳米材料 生物传感 氧化酶活性

Research on the oxidase-like activity of Fe@C nanosheets

Abstract

Natural enzymes are vital to the implementation of human beings’ daily activities. However, due to some inherent defects, such as high cost, difficult preparation and storage, their applications are limited to certain restrictions. In order to overcome these defects, many efforts have been put into the development of natural enzymes mimetics in the past decades, finding that some nanoscale inorganic materials exhibit similar catalytic activities with natural enzymes. So far, hundreds of nanomaterials are demonstrated to possess the enzymatic activity, including peroxidase, oxidase, catalase, and superoxide dismutase. Based on this major discovery, a series of biosensors have been developed and applied to many aspects of life, such as medical treatment and environmental protection. Traditional peroxidase-like mimics usually catalyze the oxidation of substrates with the prerequisite for the existence of H₂O₂, which is unstable and may do harm to the whole biological systems, so it is of great significance to further develop oxidase mimics that can directly catalyze the oxidation of substrates without H₂O₂ and apply them to practical analysis and detection.

In this work, two dimensional Fe@C nanosheets (NSs) were prepared. The oxidase-like activity of Fe@C NSs was investigated. The experimental results manifested that Fe@C NSs could catalyze the colorimetric substrate 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) in the absence of H₂O₂. Fe@C nanozymes achieved the highest activity at pH 3.5, temperature 40 ^oC, and reaction time 50 min. In addition, Fe@C nanozymes are of excellent potential in the development of novel and efficient biosensors.

Keywords: nanozymes; nanomaterials; biosensor; oxidase-like activity

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 简介 1

1.1 纳米酶简介 1

1.2 纳米酶种类 1

1.2.1 过氧化物酶 1

1.2.2 氧化酶 2

1.2.3 过氧化氢酶 4

1.2.4 超氧化物歧化酶 5

1.3 纳米酶的应用 6

1.3.1 生物传感 6

1.3.2 疾病诊断 7

1.3.3 环境保护 7

1.4 研究背景与研究内容 8

1.4.1 研究背景 8

1.4.2 研究内容 9

第二章 实验部分 10

2.1 实验试剂与仪器 10

2.1.1 实验试剂 10

2.1.2 实验仪器 10

2.2 Fe@C NSs的合成与表征 10

2.2.1 Fe@C NSs的合成方法 10

2.2.2 Fe@C NSs的表征方法 11

2.2.3 Fe@C NSs活性优化实验中的检测方法 11

第三章 实验结果与讨论 12

3.1 Fe@C NSs的表征 12

3.1.1 X射线衍射仪（XRD）结果分析 12

3.1.2 透射电子显微镜（TEM）结果分析 12

3.2 对Fe@C NSs 氧化酶活性的探究 13

3.3 Fe@C NSs 氧化酶活性实验条件优化 13

3.3.1 Fe@C NSs的浓度对氧化酶活性的影响 13

3.3.2 体系pH对Fe@C NSs 氧化酶活性的影响 14

3.3.3 反应温度对Fe@C NSs 氧化酶活性的影响 15

3.3.4 反应时间对Fe@C NSs 氧化酶活性的影响 15

3.3.5 底物浓度对Fe@C NSs 氧化酶活性的影响 16

第四章 结论与展望 18

参考文献 19

致 谢 23

第一章 简介

1.1 纳米酶简介

天然酶是真正杰出的生物催化剂，介导所有生物的每一个生物过程。天然酶以其高底物特异性、高反应效率和温和反应条件的特点得到了广泛的研究与应用。但是它们存在一些固有的缺点，例如低稳定性、催化活性对环境条件的敏感性以及制备、纯化与运输条件的高成本等，因此天然酶的实际应用受到了一定的限制^[1]。为了解决以上问题，人们将关注点放在了天然酶替代物的研究上^[2]。在此背景下，纳米酶以它特殊的性质，吸引了科研工作者的巨大兴趣。较之天然酶，纳米酶具有成本低、结构设计灵活和化学稳定性高等优点^[3]。同时，它们的酶活性可以通过表面修饰^[4]、尺寸调节^[5]和构成调整^[6]来调节。近年来，新型纳米材料作为酶模拟物的研究越来越多，基于纳米酶的传感平台以其简单和廉价的优点而逐渐成为生物分析和医疗诊断中的重要研究工具。

1.2 纳米酶种类

2007年，Yan课题组^[7]发现无机材料Fe₃O₄在纳米尺度呈现出与天然酶-辣根过氧化物酶（HRP）类似的活性，且催化效率与天然酶也相差不大。从此之后，数百种可模拟过氧化物酶^[8-12]、氧化酶^[13-19]、过氧化氢酶（CAT）^[20-23]和超氧化物歧化酶（SOD）^[24-29]等活性的纳米材料已被发现。

1.2.1 过氧化物酶

近一个世纪以来，过氧化物酶作为生物化学研究的主要对象得到了广泛的研究，通常，过氧化物酶是在各种生物体内发现的天然酶，它们参与了基于氧化还原过程的许多生化反应^[8]。到今天为止，大量具有不同结构和组成的无机纳米材料已被合理地设计为过氧化物酶催化反应中的酶模拟物^[12]，如金属氧化物^[9]、贵金属^[10-11]和纳米复合材料^[12]等。

1. 金属氧化物

如上所述，Yan等^[7]发现了Fe₃O₄纳米颗粒（NPs）的过氧化物酶活性。此外，Nie等^[9]采用一步水热法制备了高质量的块状VO₂纳米带（VO₂ NBs）。基于VO₂ NBs的过氧化物酶活性，构建了一种可在较宽的线性范围（1-400 μM）内快速检测H₂O₂的比色传感平台，其检出限为0.28 μM。通常盐酸多巴胺（DA）、L-抗坏血酸（AA）和柠檬酸（CA）等干扰物可能会影响比色测定中H₂O₂的反应，但是在将这几个物质作为检测物质时，吸光度并无明显变化，所以此传感器对H₂O₂的检测具有极高的选择性。

1. 贵金属

Ju等^[10]制备了平均尺寸约为34 nm的带正电的Au NPs（( )AuNPs），并证明了( )AuNPs具有过氧化物酶活性，基于此构建了一种高选择性和高灵敏度地检测H₂O₂的比色法。此材料检测H₂O₂的线性范围为2-200 μM，在pH 4.0、温度为45 ℃时表现出最优的酶活性，检出限为0.5 μM。Jin等^[11] 用酵母提取物作为稳定剂和还原剂，采取简易的一锅法制备了一种新型的超小型Pt纳米簇（Pt NCs）并证明了其具有的过氧化物酶活性。在此基础上，开发了一种新型高灵敏度检测葡萄糖的比色法，检出限为0.28 μM，且已被成功地应用到了人血清葡萄糖的检测中。

1. 纳米复合材料

Li等^[12]合成了一种杂化Pt@EMT沸石纳米材料，此材料稳定性较好，可以在较宽的pH（2.0-9.0）和温度（0-50 ℃）范围内保持良好的过氧化物酶活性。基于此构建了一种检测葡萄糖和H₂O₂的比色法。该方法可在较宽的线性范围内（0.09-0.27 mM）对葡萄糖和H₂O₂进行精确检测，检出限分别为13.2 μM和1.1 μM。此外，该方法还可以准确地测量包括人血清和果汁等真实样品中的葡萄糖含量。

1.2.2 氧化酶

与过氧化物酶模拟物不同，氧化酶模拟物可以在没有额外的氧化剂（H₂O₂）的情况下催化底物的氧化，目前常见的氧化酶模拟物有贵金属^[13]、金属氧化物^[14-15]、金属有机骨架（MOFs）^[16]和杂化纳米材料^[17-19]等。

1. 贵金属

Li课题组^[13]发现了特异性生物硫醇对Ag 的氧化酶活性具有抑制作用。基于此开发了一种无标记的灵敏荧光法来检测包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)在内的生物硫醇。

1. 金属氧化物

He等^[14]发现单层MnO₂ NSs的氧化酶活性可以进行将无色的TMB氧化成深蓝色产物(oxTMB)的显色反应。在引入AA后，MnO₂被还原成Mn² ，导致TMB显色反应程度下降，同时会导致体系吸光度迅速降低，基于此建立了一种快速、高选择性地检测水溶液中AA的比色传感器，反应机理如图1-1所示。此外，Wang课题组^[15]制备的微球型的MnO₂同样具有良好的氧化酶活性，基于此构建了一种可检测碱性磷酸酶(ALP)活性的高性能比色传感平台，ALP的线性范围为0.5-120 U·L^-1，其检出限为0.42 U·L^-1。在作为生物硫醇的有效掩蔽剂N-乙基马来酰亚胺的帮助下，该比色法可为ALP活性检测提供优良的特异性。

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