论文总字数：13698字

摘 要

选用未修饰的石墨烯量子点（GQDs）为荧光团，选择Hg² 作为淬灭剂，由于GQDs带负电荷，Hg² 带正电荷，静电相互作用使得Hg² 附着到GQDs表面，淬灭其荧光。选择巯基乙酸甲酯（MT）作为脂肪酶的底物，催化水解可以生成巯基乙酸（TGA），TGA会和Hg² 之间可以形成更强的键。当脂肪酶和MT加入溶液中时，水解产生的TGA会使得原先吸附在GQDs上的Hg² 被强制剥落与其结合，石墨烯量子点重新变得裸露，荧光重新恢复，恢复的数值与加入溶液中脂肪酶的活性有关，因此这一原理可以用作一种检测脂肪酶活性的方法。

然后通过控制变量法进行实验来寻找反应的最优条件，发现Hg² 用作淬灭剂淬灭效果最好，Hg² 的最佳浓度为 290 µM，反应底物MT的最佳浓度为 1.4 mM，酶水解反应溶液的最佳 pH 值应控制在8.0，最佳反应温度为38 ℃。选择到了四种市面上买得到的脂肪酶，控制在最优条件下对其进行活性检测，然后有用恒定电位法对酶活性进行检测，发现两种方法测得的数值基本一致，这进一步证实了这种检测方法是可行的。

关键词：脂肪酶 石墨烯量子点 酶活性 荧光传感

A quantum dot fluorescence sensor was constructed to detect lipase activity

ABSTRACT

In this article, graphene quantum dots (GQDs) was chosen as the fluorescene element. Because GQDs is electronegative and Hg² is electropositive, the electrostatic interaction makes Hg² attach on the surface of GQDs, then the fluorescence of GQDs was quenched. Thioglycolic acid methyl ester (MT) was chosen as the substrate of lipase, it can be hydrolyzed to TGA, which can form stronger bond with Hg² . When the lipase and MT were added in the solution, thioglycolic acid (TGA) was produced by lipase hydrolysis which will rob Hg² from GQDs, thus graphene quantum dots become bare and the fluorescence was restored. And the strength of the recovery is associated with enzyme concentration. We can use this method to detect the lipase activity.

Then, we tried to look for better conditions for this reaction, and it was found that the optimal concentration of Hg² was 290 µM, the optimal concentration of MT was 1.4 mM, the optimal pH value of lipase hydrolyzed MT was 8.0. And the most suitable reaction temperature was 38 ℃. Adjust all conditions to optimum, several kinds of commercial lipases were detected, and the experimental results were basically the same as those obtained by the constant potential method, which proved the practicability of this method.

Keywords: lipase; graphene quantum dots; enzyme activity; fluorescence sensor

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1引言 1

1.2脂肪酶及其检测 1

1.2.1脂肪酶概述 1

1.2.2脂肪酶的结构 2

1.2.3脂肪酶的催化机理 2

1.2.4脂肪酶的检测 2

1.3量子点及其优越性 3

1.4石墨烯量子点的制备方法 3

第二章 实验部分 5

2.1实验仪器 5

2.2 实验药品 6

2.3 溶液的配制 6

2.4检测脂肪酶活性 7

2.5 恒电位滴定法检测脂肪酶活性 7

第三章 结果与讨论 8

3.1传感机理分析 8

3.2 传感方法的验证 8

3.3反应条件的选择 9

3.3.1 淬灭剂的选择 9

3.3.2 Hg² 的浓度 10

3.3.3 底物MT的浓度 10

3.3.4 溶液的pH 11

3.3.5 水解反应的温度 12

3.4 实际样品的检测 13

3.5小结 14

参考文献 16

致谢 19

第一章 文献综述

1.1引言

脂肪酶归属于羧酸水解酶类，可作用于羧酸酯键，在自然界中主要存在于原核生物和真核生物体内。具有催化特异性高、反应条件温和以及副产物少对环境友好等特点，是一种重要的工业用酶，在食品生产、化工生产、药物合成以及生命科学领域的研究中得到了广泛应用^[1-4]。酶的活性是酶最重要的性质，因此寻找更加简便快捷的脂肪酶活性检测方法成为了一个重要的研究课题。目前人们已经发现的检测方法有比色法、酸碱滴定法^［5］、浊度法^［6］，光度法以及荧光法^［7］等。

近来，以碳为基本元素的发光纳米材料（CLNM）受到了人们广泛的关注。这种材料通常低毒，高发光，化学惰性强且易于制备。常见的CLNM有碳纳米管（CNT），纳米金刚石，碳量子点（CQDs）等。两种新型的发光碳纳米材料被发现，氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）^[8]和石墨烯量子点（Graphene quantum dots, GQDs）^[9]，这两者相较于普通CLNM而言有更多的优点，吸引人们越来越多的关注。GO是一种石墨薄片，使用含氧官能团共价修饰基平面或其边缘。而GQDs是小于100 nm的石墨烯片，人们发现它具有独特的光学和电子特性，仔细研究发现了它的两个特征，即量子限制和边缘效应。通常，GQDs的尺寸要比GO小得多，并且光致发光活性要比GO强很多。GQDs可以发出稳定的荧光并且强度很大，激发波长和发射波长经实验发现都是可调控的，并且处在可见光区的荧光发射峰很容易观察到。GQDs相较于一般的CLNM而言粒径更小，毒性低、无“光闪烁”现象，它的生物相容性好，便于实现表面功能化，在酶活检测中展示出了无限的应用前景^[10-12]。

1.2脂肪酶及其检测

1.2.1脂肪酶概述

脂肪酶（三酰基甘油水解酶, EC 3.1.1.3）是一种重要的工业用酶，在自然界中主要存在于含有脂肪的动物植物微生物中。酶类作为催化剂，可以极大程度改变生化反应的反应速率，脂肪酶能参与的反应种类很多，有酯化、醇解、催化水解等。脂肪酶的选择性很强，只能够选择性的催化水解某些特定的物质，并且催化过程

不需要任何辅助因子。自然界中，脂肪酶主要参与催化水解甘油酯类物质的水解^[13]和合成^[14]。经大量的研究，科学家们发现脂肪酶还能够特异性的催化水解羧酸酯中的酯键^[15]，生成脂肪酸和醇。由此可见，脂肪酶可参与的催化反应种类多种多样，但是参与反应的底物只能是专一的。这些特征使得它在食品生产、化工生产、药物合成以及生命科学领域的研究中具有十分广泛的应用_。

1.2.2脂肪酶的结构

1990年，人们第一次准确解析了一种叫做米黑根毛霉脂肪酶的晶体结构^[16]。经过数百年来的发展，现如今已经有几百种脂肪酶的结构被人们认知。经大量研究发现，影响脂肪酶结构的因素主要是其结合的底物以及所处的溶剂环境。事实上，不同脂肪酶的一级结构是相差比较大的，分子量也相差很多。但是不同脂肪酶的二级和三级结构十分相似，α-β折叠结构是其共有特征，这是一种催化三联体结构，由丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸共同组成^[17]。

1.2.3脂肪酶的催化机理

脂肪酶的α-螺旋顶部打开，底物进入体系内的活性中心与脂肪酶结合，活性中心上的丝氨酸被活化，其羟基上的氧原子会攻击底物酯键上的羰基，羰基的双键被四种不同的原子亲核加成，从而形成一种四面体结构。四面体转动使得组氨酸上的质子转移到底物的酯键上，使得酯键断裂生成醇羟基从四面体中脱落与丝氨酸进一步结合，形成一种酰基-酶共价复合物。组氨酸失去的质子从水或者醇的底物分子中补充，这会活化底物分子水或者醇，从而攻击丝氨酸上的碳原子，致使与底物之间的酯键断裂，释放羰基部分的产物，这就完成了脱酰基的过程^[18]。

1.2.4脂肪酶的检测

脂肪酶在生物化工领域的大量应用，使得对其活性的检测研究成为有机应用领域的一个重要课题。但是催化反应的过程必须在油-水界面上进行，反应前必须经过乳化处理，但乳化剂的加入会产生一定的信号干扰，导致分析体系更加复杂，并对测量结果产生巨大影响^[19]。因此脂肪酶活性的检测要比常见一些其他的水解酶更难以处理。

1.3量子点及其优越性

量子点（quantum dots）指的是大小在1～10nm 之间，主要由Ⅱ－Ⅵ族及Ⅲ－Ⅴ族元素组成的一种半导体纳米晶体，是近年来发现的一种高级传感材料。量子点吸收激发光的能力很强，这得得益于自身非常高的激发重叠区。所以荧光量子效率远在传统有机染料之上，甚至可以达到后者的1000倍，这使其可以用于浓度极低的目标分子检测^[20]。量子点的荧光性能也是传统的荧光染料所远不能及的，高消光系数、高荧光量子产率、尺寸依赖性发射，以及优异的光化学稳定性，都让人们不得不对这种新型传感材料倍加关注。

请支付后下载全文，论文总字数：13698字