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摘 要

S Blincko and R Edwards曾报道过发现一种荧光非分离亲和法测定总糖化血红蛋白的方法，该方法的原理是某些硼酸的荧光衍生物在与糖化血红蛋白结合时被淬灭，而在未结合时则不被淬灭。本课题中我们对之前文献报道的相关物质进行了调整。将用曙红-5-硫代苯硼酸三乙胺盐作荧光剂来与糖化血红蛋白结合形成荧光淬灭检测糖化血红蛋白，并使用AHD-575法检测总血红蛋白，最后两次测量的比值通过数值换算可以得到样本中HbA1c在血红蛋白总量中的占比。此方法设计检测路线合理，CVlt;4 % 检测情况良好。

关键词：糖化血红蛋白 荧光分光光度法 荧光淬灭 曙红Determination of glycated hemoglobin HbA1c by fluorescence spectrophotometry

Abstract

S blincko and R Edwards have reported the discovery of a fluorescence non separation affinity method for the determination of total glycosylated hemoglobin. The principle of this method is that some fluorescent derivatives of boric acid are quenched when they are combined with glycosylated hemoglobin, but not when they are not combined. In this project, we have adjusted the related substances reported in the previous literature. Using eosin-5-thiophenylboronic acid triethylamine salt as fluorescent agent to combine with glycohemoglobin to form fluorescence quenching method to detect glycohemoglobin, and using AHD-575 method to detect total hemoglobin, the ratio of HbA1c in total hemoglobin in the last two measurements can be obtained by numerical conversion. The design of this method is reasonable, CV lt; 4% is good.

Key Words: glycated hemoglobin; fluorescence spectrophotometry; Fluorescence quenching; Eosin

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1糖化血红蛋白概述 1

1.1.1糖化血红蛋白定义 1

1.1.2 糖化血红蛋白值测量的重要性 1

1.1.3 检测糖化血红蛋白的意义： 2

1.1.4糖化血红蛋白检测的特点： 2

1.1.5糖尿病检测手段发展现状 3

1.2糖化血红蛋白的研究进展 3

1.2.1 高效液相色谱法（HPLC） 3

1.2.2电泳 3

1.2.3等电聚焦 4

1.2.4免疫比浊法 4

1.2.5酶法 4

1.3 荧光分光光度法在检测GHb的应用 5

1.3.1荧光光度法 5

1.3.2荧光分光光度法检测GHb水平机理 5

1.4 本论文选题的内容及意义 6

第二章 糖化血红蛋白HbA1c的荧光分光光度法测定 7

2.1实验试剂及仪器 7

2.2荧光增强作用 8

2.2.1增效剂的选取 8

2.2.2荧光增强原因的探索 9

2.3淬灭时间的选取及其稳定性探究 13

2.3.1淬灭时间的选取 14

2.3.2淬灭的稳定性 14

2.4总血红蛋白的标定及糖化血红蛋白的标定 15

2.4.1总血红蛋白的标定 15

2.4.2糖化血红蛋白的标定 16

2.5荧光分光光度法测定糖化血红蛋白水平 17

2.5.1 实验方法 17

第三章 结论与展望 20

3.1 结论 20

3.2 展望 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 绪论

1.1糖化血红蛋白概述

1.1.1糖化血红蛋白定义

糖化血红蛋白(GHb)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类发生持续非酶促反应的产物。血液中的葡萄糖可发生自由扩散进入到红细胞，从而与红细胞中的Hb糖基化位点结合，发生非酶促蛋白糖基化反应，产生GHb。血糖和Hb结合生成GHb是一个不可逆的过程，血糖的浓度越高，血糖与Hb接触时间越久GHb含量越高。一般情况下，红细胞的正常寿命约为120 天，因此，GHb水平在体内能维持约120 天。相关研究表明，Hb在人体内的存在形式有三种，而且不同形式的Hb表面携带的电荷不同，则GHb也存在三种形式，分别由HbA1a、HbA1b、HbA1c组成，其中HbA1c约含70 %，且结构稳定，目前已被用作糖尿病控制的重要检测指标。该物质最初是于1958年用色谱法首次从其它类型的血红蛋白中分离出来，该物质最初发现的时候科学家们都以为是一种变异的血红蛋白，直到1968年才发现其是一种被糖化的血红蛋白，并归类为一种糖蛋白。之后的很多年来科学家对它的研究从未停止，直到2010 年ADA将GHb含量作为诊断糖尿病的主要依据，并规定当检测患者GHb含量大于6.5 %时则可以诊断为糖尿病。^[1]

1.1.2 糖化血红蛋白值测量的重要性

随着社会的飞速发展，人们的生活水平日益提高，日常生活的饮食也越来越趋向于高营养品的摄入，这无疑就会增加自身血糖异常的风险，最终导致糖尿病患者越来越多，且不分性别，逐渐年轻化，极大的威胁着人类身体健康。^[2，3]目前糖尿病仍然属于一种难以治愈的疾病，我国目前糖尿病患者已达1.14 亿，每年约有100 万的人死于糖尿病，约占我国年平均疾病死亡人数的15 %。面对如此庞大的患病人数，到目前来说还没有研制出可以完全治愈的特效药，所以控制和检测血糖水平是眼前的首要任务。而且糖尿病可能在治疗过程中由于药物的催化作用而演化出多种并发症，^[4-7]这就显得血糖的检测格外的重要，以往，我们检测的是空腹或餐后2 h的血糖水平，但这仅仅表示患者采血瞬间的血糖水平，极易受外界影响，从而导致检测结果不准确。而GHb的检测数据就比较稳定客观，血糖和Hb结合是一个不可逆的过程，GHb不会受到血糖忽然升高或者降低的影响，且该指标在临床检测过程中与采血的时间、患者有没有使用胰岛素以及是不是为空腹等外界因素均无明显的影响。^[4]因此可用于临床辅助筛查糖尿病，以便于临床调整药物的使用剂量或者为临床治疗方案提供参考。

1.1.3 检测糖化血红蛋白的意义：

糖化血红蛋白增高对人体的影响是多方面的，除了可以导致糖尿病外，它还可以改变血红蛋白与氧气的结合，使其不能形成氧合血红蛋白，红细胞失去运输氧气的能力，从而使组织细胞缺氧，这可加速心脑血管并发症的形成。还可引起血脂和血粘滞度增高，这些都是导致是心血管病发生的重要因素。^[8-11]也可以引起肾小球实质性的细胞增生，导致肾小球毛细血管肥大，细胞数增多，从而诱发糖尿病肾病（DN）等。因此，检测糖化血红蛋白水平以下几个方面都有重要的意义。

1、有助于糖尿病慢性并发症的认识；^[12，13]

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