论文总字数：18804字

摘 要

长期以来，由于真菌，细菌接触到医疗器械而造成伤口的感染已成为了一个日益严重的问题。利用光固化水凝胶的可控注射性、良好力学性、快速光交联性等优点而生产的抗菌水凝胶涂层成为了解决上述问题的有效手段。但由于紫外光的能量较高很容易造成凝胶涂层表面物质（如蛋白质，药物等）的失活。故本实验着重研究通过改性ε-聚赖氨酸制造出能够在可见光照射下便可固化成胶的高效安全的抗菌水凝胶产品，通过核磁检测改性ε-聚赖氨酸的结构，并对产品在可见光照射下的成胶能力进行测试后确定其在不同产品（或交联剂）浓度下的成胶时间，最后对产品的抗菌性和选择性进行检测，并通过这些数据进一步完善产品，以便尽早投入使用。

关键词: ε-聚赖氨酸；水凝胶；抗菌；可见光

ABSTRACT

Medical devices have become a growing problem for wounds caused by contact with fungi and bacteria for a long time. The antibacterial hydrogel coating produced by the controlled injection property, good mechanical properties and rapid photocrosslinkability of the photocurable hydrogel has become an effective means for solving the above problems. However, due to the high energy of ultraviolet light, the surface substances (such as proteins, drugs, etc.) of the gel coating are easily deactivated. Therefore, this experiment focuses on the production of highly effective and safe antibacterial hydrogel products that can be cured by visible light irradiation by modifying ε-polylysine. The structure of modified ε-polylysine is modified by nuclear magnetic resonance. The gelation ability of the product under visible light irradiation is tested to determine the gelation time at different product (or crosslinker) concentration. Finally, the antibacterial property and selectivity of the product are tested and further improved by these data. Products so that they can be put into use as soon as possible.

Key words：ε- Polylysine; Hydrogel; coating;Visible light

目录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 绪论 1

1.1前言 1

1.2 水凝胶（Hydrogel） 2

1.2.1水凝胶的分类 2

1.2.2水凝胶的应用 3

1.3 聚赖氨酸水凝胶 4

1.3.1 ε-聚赖氨酸 4

1.3.2 改性ε-PL 4

1.4 甲基丙烯酸酐（MA） 5

1.5 ε-PL水凝胶制备方法 5

1.6 技术路线 6

1.7小结 7

第二章 实验部分 8

2.1主要试剂及仪器 8

2.2 实验步骤 9

2.2.1二甲基丙烯酸酐改性聚赖氨酸 9

2.2.2甲基丙烯酸酐改性ε-PL（EPL-MA）水凝胶的制备 9

2.3 EPL-MA 测试与表征 9

2.3.1核磁共振氢谱(¹H-NMR) 9

2.3.2 EPL-MA成胶测试 10

2.3.3水凝胶导电玻璃上抗菌效果对照试验 10

第三章 结果与讨论 11

3.1 EPL-MA的合成 11

3.2 凝胶化过程 12

3.3 抗菌性和选择性 14

第四章 讨论总结 16

致 谢..........................................................................................................................22

1. 绪论

1.1前言

细菌感染是由病原性细菌或条件致病菌侵入血液循环，产生毒素和其它代谢物的急性全身性感染。它会影响人们的健康和生活质量，是长期困扰人类医学问题^[1]。我们迫切需要开发新的抗菌药物和研究方法来解决这个问题。其中利用ε-聚赖氨酸作为主体原料固化所形成的具有抗菌作用的聚赖氨酸涂层日益受到了越来越多的关注。在目前用于创伤修复的材料中，水凝胶最接近于人体组织。高分子水凝胶是由三维网络结构的大分子和溶剂水组成的，其网络大分子主链及侧链上有亲水性基团，网络可以吸收溶剂溶胀而不溶解，是一类软物质材料由于水凝胶本身具有亲水性基团，所以能够大量吸水而发生溶胀，水的含量能够达到水凝胶干重的10%~20%，甚至数千倍^[2]。水凝胶表面对细胞、蛋白质的亲和性较弱，与体液、血液等人体内环境接触时，展现出优良的生物相容性和安全性，不会影响组织的生命代谢，同时降解产物安全无毒，可以被人体吸收或排出^[2]。因为水凝胶自身含有一定的水分，并且具有一定的柔韧性，所以水凝胶在一定程度上可以模拟皮肤的某种性能，研究表明，通过使用合适的材料可以减少水凝胶对人体的刺激性，对人体皮肤和细胞有很好的亲和性^[2]。这种可在人体内水解的水凝胶是一种绿色的组织材料，当使用过程中接触血液或人体组织时，它不会影响人体正常的新陈代谢，并且它的代谢产物也不会影响人体正常的生理活动^[1]。因为水凝胶会吸取大量的水分进行溶胀，并且不会因为溶胀而改变原来的结构发生降解，具有相当好的生物相容性。聚氨基酸是一类可降解的生物仿生类高分子，对生物体无毒、无副作用、无免疫源性，具有良好的生物相容性，并可通过体内的水解或酶解反应最终降解为小分子的氨基酸，被人体吸收^[2]。本文通过对聚赖氨酸结构进行裁剪、修饰和其他单体通过重组作用和构型异变，进一步合成三维网状结构水凝胶结构完好，具有可降解性和其他功能性、理化性质（流变性能，溶胀率，亲疏水性）较自然水凝胶好的优势特点，以解决皮肤组织结构的特异性和创面修复过程存在的种种问题^[3]。

1.2 水凝胶（Hydrogel）

水凝胶（Hydrogel）是能够吸收大量的水或生物液体的亲水性聚合物的三维网络。该网络由均聚物或共聚物组成，并且是不溶的，例如缠绕或微晶由于化学交联或物理键的存在。后者提供网络结构和物理完整性。这些水凝胶表现出与水的热力学相容性，使它们在水性介质中溶胀^[3]。

自Wichterle和Lim于1960年开始研究交联HEMA水凝胶以及由于其亲水性和生物相容性以来，水凝胶多年来一直受到生物材料科学家的极大关注。1980年Lim和Sun的重要和有影响力的工作 证明了海藻酸钙微胶囊在细胞包封中的成功应用^[4]。 在20世纪80年代后期，Yannas及其同事将天然聚合物（如胶原蛋白和鲨鱼软骨）纳入水凝胶中，用作人工烧伤敷料^[4]。

1.2.1水凝胶的分类

根据水凝胶由来、大分子构成成分、晶体形态、制备方法、带电状态、交联点性质等类别可以将水凝胶进行如下分类。具体如下：根据来源分类，自然水凝胶：包括胶原、胶质、多糖类化合物（SA、淀粉、琼脂糖、DEX、ALG，HA）等。合成水凝胶：是通过化学交联手段制备得到的水凝胶。如：聚酯，聚磷腈和聚乙二醇PEG^[5]。

在过去的20年中，天然水凝胶已逐渐被合成水凝胶所取代。与自然水凝胶相比，合成水凝胶不仅对生物病原体传播风险小，而且使用周期更长，有较高的吸水性和强度，并且耐久性强；同时，合成水凝胶结构完好，具有可降解性和其他功能性、物理性质（如拉伸强度，弹性模量）较自然水凝胶好；可以由纯净的合成组份制备；在温度波动较大的环境下仍能稳定存在；其结构可进行裁剪和修饰。但合成水凝胶生物相容性低，会产生毒副产品；同时，合成水凝胶较高的力学强度导致该水凝胶降解速率缓慢。它有如下的分类^[5]：

依据环境对其刺激响应性的不同分为温度、压力、pH、光敏感性智能水凝胶。由于受温度变化机制的不同，任何物体的存在都会有热胀冷缩的不同程度的变化，鉴于此就有热缩型温度敏感型水和热胀型温度敏感型水凝胶的存在^[6] 。

在生物材料领域工程运用的环境中尤其是生物体中酸碱变化常常存在，突发性，不随时间的变化具有就被开发适应环境的需求。pH-响应水凝胶通常是一超

分子分子与网络交联结构。当pH和生物系统或其它环境变化的离子强度，在自由状态下的酸性或碱性基团使网络连接^[7]。分子链段的氢键碰撞而断裂，和水凝胶的体积发生变化，以便能够表现出来，从而实现期望的效果^[5-6]。

光敏感性水凝胶依据其在光源的照射下产生不同反馈效果而分为有可见与紫外两类光敏感性高分子水凝胶。由于上个世纪软物质概念的提出，因此在生物材料领域，光致变色的材料有不可取代的优势。在光敏感性高分子网络中引入光敏感的发色基团（如偶氮苯、螺吡喃、重氮盐和噻嗪光学活性的官能团）结构单元，能成功的制备光敏感高分子水凝胶^[7]。

1.2.2水凝胶的应用

水凝胶不仅仅是研究对溶胀聚合物网络的基本方面感兴趣的研究人员的研究，而且还在不同的技术领域中得到广泛应用，例如，作为隐形眼镜和蛋白质分离的材料，用于细胞包封的基质和用于控制释放药物和蛋白质的装置。此外，水凝胶具有结构相似性高分子在体内基于组件，被认为是生物相容的。水凝胶已经在组织工程和药物递送中发现了许多应用。 组织工程是水凝胶的最新应用，它们被用作支架以设计新组织^[5]。

具有液体状和固体状行为的水凝胶具有多种功能特性，例如溶胀，机械，渗透，表面和光学性质。这些性质在医药，农业，生物技术等领域提供了水凝胶的许多潜在应用。此外，水凝胶具有响应于环境变化而从其塌陷和溶胀状态经历突然体积变化的独特性质。响应于环境刺激而经历体积变化的刺激敏感水凝胶是智能材料，具有传感器和效应器功能。他们可以将刺激感知为信号，并自行引发结构变化。由于刺激敏感的水凝胶的迷人特性，可以肯定的是它们将具有许多未来应用作为用于智能生物材料和自我调节药物递送系统的设计的合适材料^[5]。因此，已开发出各种刺激敏感的水凝胶用于开关，传感器，机械化学致动器，药物输送装置，专用分离系统，生物反应器和人造肌肉^[6]。

刺激敏感的水凝胶作为生物化学和生物医学领域的智能材料已引起相当的关注，它们可以感知环境变化并自身引起结构变化。特别地，响应于特定生物分子而经历膨胀变化的生物分子敏感性水凝胶由于其在生物材料和药物递送系统的开发中的潜在应用而变得越来越重要。

1.3 聚赖氨酸水凝胶

1.3.1 ε-聚赖氨酸

ε-PL（图1-1）是通过α-羧基和ε-氨基之间的酰胺键聚合的聚氨基酸 。ε-PL是一种水溶性，耐热，可生物降解和阳离子的均聚生物聚合物，ε-聚赖氨酸（ε-PL）是包含25至35个L-赖氨酸残基的天然多肽，是一种乳白色粉末，有很强的吸湿性，略有苦味。是一种安全、健康、营养且抗菌活性强的优良物质，其可以从链霉菌的固态发酵培养基中分离^[8]。它是水溶性的，可生物降解的，可食用的，对人类和环境无毒。它在高温以及酸性或碱性条件下也是稳定的，即使 ε-PL 水溶液经过 100 ℃处理 30 min，仍可保持其自身原有的长度，不会被分解，同时聚赖氨酸的抑菌活性也没有因此而发生显著变化^[2]。

它显示出广泛的抗菌活性,与α-聚赖氨酸相比，ε-PL具有更高的生物相容性，更低的细胞毒性，更易于工业化，成本更低^[8]。并且对各种食源性病原体和腐败微生物具有广泛的抗菌活性，包括酵母，真菌，大肠杆菌，李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌。一旦转换为递送系统，它可以具有广泛的应用。

在日本，ε-PL是经批准的食品防腐剂，并已通过美国食品和药物管理局（FDA，2004）授予GRAS（通常认为是安全的）状态^[8]。该化合物目前在工业上生产并且已经进入商业市场以用于某些食品应用，特别是在饮料中，因为它与这些产品中常用的各种胶凝剂（例如角叉菜胶，藻酸盐和）有利地相互作用^[9]。

图1-1 聚赖氨酸的分子结构式

1.3.2改性ε-PL

利用ε-聚赖氨酸的易修饰性以及水凝胶的广泛可调的特点将两者结合，通过

对ε-PL进行甲基丙烯酰胺接枝改性,制备可共价交联的具有热稳定性的ε-PL水凝胶^[2]。然后，引入丙烯酰胺与改性ε-PL共聚制备ε-PL以N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂制备水凝胶，解决甲基丙稀酸酐改性ε-PL水凝胶力学性能不足以及降解过快的问题^[2]。通过对甲基丙烯酸酐改性ε-PL和N,N-亚甲基双丙烯酰胺复合水凝胶的研究，调控该水凝胶的组分与结构，使其不单具备良好的生物相容性,还具备良好的力学性能^[2]。使其可在可见光照射下便可固化成胶，降低了产品的应用条件，提高了产品的使用范围。

1.4 甲基丙烯酸酐（MA）

甲基丙烯酸酐（图1-2）是一种常温下为液体的一种酸性有机液体，无色透明液体，常温常压下稳定，密度1.035（20℃），沸点87℃，折射率1.453，闪点184℃。它是一种较强的酯化剂,是制备甲基丙烯酸硫酯,甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯(尤其是叔醇的酯)所必需的试剂,同时可作为聚合反应交联剂用于光固化涂料、交联树脂等材料的合成^[14]。其分子结构式如下：

图1-2 甲基丙烯酸酐结构式

1.5 ε-PL水凝胶制备方法

水凝胶的制备通常通过在含亲水基的单体体系中引入含其他活性基团的交联剂，从而使大分子进行交联。在成胶过程中可以通过共价键、范德华力或者氢键使分子之间相互聚合而成一种特殊的三位网状结构，继而可使用增量制造点胶技术等方法将水凝胶等材料打印成型^[2]。天然和合成的水溶性线性聚合物形成水

凝胶有如下几种交联方法：自组装、氢键作用、π-π堆积作用、金属或离子键作用、二硫化反应、疏水作用、硫醇/丙烯酸酯迈克尔反应、希夫碱反应、酶促反应、和主客体作用等，化学试剂交联与辐射交联通常有三种方法制得：单体交联聚合、水溶性高分子交联和接枝共聚法^[22]。含有反应性基团的凝胶分子之间进行交联反应，如通过引入交联剂来诱导体系成胶。化学交联种类较多，包括羟基交联、羧基交联、希夫碱作用、双键交联、Staudinger交联、光交联等。这类交联方法通常会引入交联剂，如：光敏剂。有很多文献在研究如何提高光引发水凝胶的实用性，因为光引发水凝胶直接通过紫外光照射交联形成水凝胶，不仅交联而成的共价键非常稳定，并且对水凝胶形貌的控制具有特殊的意义。

1.6 技术路线

EPL-MA水凝胶的EPL-MA和制备和表征的合成。首先，ε-PL与MA的接枝改性进行。EPL-MA以不同浓度和交联度通过改变MA和ε-PL的质量比制备，并且EPL-MA的结构经核磁共振。然后，将具有不同的浓度和交联度的EPL-MA的水凝胶通过紫外光引发自由基聚合的制备方法，并考察不同浓度、交联度对EPL-MA水凝胶的成胶时间、粘弹性、溶胀性能、力学性能、内部微观结构和降解性能等性能的影响；最后，筛选出具有优异综合性能的EPL-MA水凝胶进行下一步研究。反应方程式为（图1-3）：

图1-3 EPL-MA生成反应方程式

合成和EPL-MA水凝胶的表征：EPL-MA在上述步骤中选择的主要成分，丙烯酰胺被引入，并通过可见光自由基聚合来制备EPL-MA的几个不同比率。

水凝胶;研究组分浓度上的流变性能，溶胀性能和EPL-MA，BIS水凝胶的多孔结构的效果。然后，具有优良的机械性能和适于细胞生长的多结构，选择EPL-MA水凝胶的最佳比例，以研究它们的粘弹性，溶胀性，降解性，蛋白质加载和释放性质。与水凝胶组分和结构的关系^[2]。

1.7小结

对皮肤组织结构的特异性和创面修复过程存在的种种问题，以具有广谱抗菌效果的天然生物高分子材料ε-聚赖氨酸（ε-PL）为主体原料，通过在ε-PL主链上修饰二甲基丙烯酸酐(MA)分子，得到EPL-MA聚合物，并利用UV固化的方法制备ε-PL水凝胶。聚氨基酸类水凝胶是一种具有良好的生物相容性和可降解性的新型高分子材料，在药物载体材料，组织工程材料的应用方面有很好的应用前景^[2]。而要更好的实现这些方面的应用就要考虑研究新型的聚氨基酸水凝胶，这就需要我们对其合成方法和修饰方法进行多方面的改进^[2]。其次为了实现聚氨基酸类水凝胶的日常普及化，就需要我们从降低成本方面来进行考虑使其更加的适应工业生产的要求。本实验该水凝胶表现出成胶时间、溶胀性能可调控和较好的降解性能，同时具有适合皮肤细胞粘附增值的三维网络多孔结构和优异的亲水特性，该水凝胶材料为抗菌敷料的构建提供了新的思路，更易于被人体接受，效果更好，在临床抗感染材料中具有较好的应用前景是聚氨基酸类水凝胶的一个很好的研究方向，此外，其在可见光照射下便可固化成胶的特性降低了成本，也减小了伤口因紫外光而引起的二次伤害及传递药物结构被破坏的可能性。也可以利用水凝胶其他方面的特性，如药物传递，刺激敏感等，与EPL-MA相结合，开发出可进入人体内部抗菌抑菌的药物，进一步改善医疗条件。

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