论文总字数：19371字

摘 要

本课题研究了黑水虻在进食小猪饲料条件下的肠道细菌的多态性，初步分析了肠道细菌的组成部分即对在Luria-Bertanin培养基上进行平板划线，37度恒温箱中培养的纯化细菌进行Biolog鉴定，最终鉴定结果有三种细菌，分别为鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii，肺炎克雷伯杆菌 Klebsiella pneumoniae ss pneumoniae，奇异变形杆菌 Proteus mirabilis。

关键词：黑水虻 肠道细菌 多态性

Polymorphism analysis of intestinal bacteria in Black Soldier Fly

Abstract

It is a kind of important resource environmental insect, which can quickly convert organic wastes such as kitchen waste, livestock excrement, spoiled fruit, stale grain and food processing waste into its own biomass. It is found that the microflora of the intestinal tract of the Black Soldier Fly plays an important role in its biodegradation.

This study studied the polymorphism of intestinal bacteria in the condition of feeding piglet feed, and analyzed the components of intestinal bacteria, which were plated on Luria-Bertanin medium, 37 degree incubator. The purified bacteria cultured in the medium were identified by Biolog. The final identification results showed that there were three kinds of bacteria, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae ss pneumoniae, Proteus mirabilis.

Key words: Black Soldier Fly; Intestinal Bacteria; Polymorphism

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1黑水虻概述 1

1.2黑水虻国内外研究进展 1

1.2.1黑水虻国内研究进展 1

1.2.2黑水虻国外研究进展 2

1.3宏基因组技术 3

1.3.1概述 3

1.3.2当代宏基因技术的发展 3

1.4研究目的及意义 5

1.4.1研究目的 5

1.4.2研究意义 5

第二章 实验材料及方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1黑水虻 6

2.1.2 实验仪器 6

2.1.3 实验药品及试剂 7

2.2 实验方法 7

2.2.1 黑水虻肠道的提取 7

2.2.2 肠道细菌的提取 8

2.2.3 细菌基因组DNA的提取 8

2.2.4 肠道细菌的Biolog鉴定 10

第三章 结果与分析 14

3.1 黑水虻肠道DNA的提取 14

3.1.1黑水虻肠道DNA提取结果 14

3.1.2 DNA提取结果分析与思考 16

3.1.3 宏基因测序结果 16

3.2 黑水虻肠道细菌的Biolog鉴定 17

3.2.1 黑水虻肠道分离细菌镜检 17

3.2.2 Biolog鉴定结果 18

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

参考文献 24

致谢 26

第一章 文献综述

1.1黑水虻概述

黑水虻（Black Soldier Fly），腐生性的水虻科昆虫，通常以猪、羊等畜类以及鸡鸭鹅等禽类的排泄物为食物，而且对于人们日常生活所产生的餐厨垃圾也有很好的分解利用效果，例如可以生产出具有丰富营养并且价格高昂的饲料。同时黑水虻也具有生长繁殖迅速，培养方式极其简单的特点。还有资源丰富、能够高效转化，并且管理成本较低不易死亡的突出优势，因此可以进行大规模的养殖以及资源化利用^[2]。黑水虻作为生态环境分解者中不可或缺的一员，能够有效地将禽畜粪便以及餐厨垃圾分解后将其中的各种物质归还到无机环境中,对于生态的保护以及资源的重复使用起着重要的作用。黑水虻幼虫不仅具有着分解的作用，自己本身也是高品质的动物饲料，含有丰富的蛋白质以及脂肪等营养物质。但是如何提高转化效率、缩短转化周期以降低生产成本是黑水虻应用研究中需要解决的问题之一。因此分析黑水虻肠道^[1]细菌的多态性对于筛选出有益于黑水虻生长发育以及分解餐厨垃圾的菌群是一种有效途径，从而还能提高培养黑水虻的技术及增强其分解效率。

1.2黑水虻国内外研究进展

1.2.1黑水虻国内研究进展

早期对于黑水虻的研究是通过将Black Soldier Fly幼虫（BSFL）与功能性细菌共转化从而生产动物性饲料和有机肥料。例如喻国辉在众多科学家的研究基础之上，开拓了新的思路，创造了新的方法，提取分离出黑水虻肠道共生细菌的不同菌株进行纯培养，从而获得液体培养基，并且以这些不同菌株的液体培养基为条件对鸡粪进行预先发酵，将这些发酵产物作为黑水虻培养的饲料。研究在不同条件下进行预先发酵的鸡粪对肠道细菌以及共生菌的理化状态以及转化效率的影响。通过其不懈的努力以及坚持，在不断的失败中需找原因，最终得到了研究结果。研究结果显示，与一般培养物，例如猪饲料，小牛饲料，米饭等相比，在喂养黑水虻时适量的经过肠道共生菌的液体培养基预先发酵过的鸡粪显著增加了黑水虻处在蛹时期的平均重量，与此同时还发现预先发酵过的鸡粪对于成年黑水虻的身体的长度以及重量也有着显著提升的作用。虽然我们看到了其优势的一面，但其不足之处是对于对幼虫存活率、成虫羽化率以及成虫寿命的提高几乎没有什么显著的效果^[1]。在这之后，徐健也同样以将黑水虻作为了研究对象,经过反复的研究以及适当的假设，设计培育了多种含有不同功效的细菌的复合物，并且以这些复合菌为条件，对米饭，小牛饲料，秸秆进行了深度发酵，并且将这些发酵好的产物作为培育黑水虻的原料。在经过几周的培育之后，通过测量身长，体重等理化指标来探究复合菌发酵产物的影响以及未来研究的展望^[2]。在这之后又有了在不同光^[3]、温度、pH等条件下^[4-6]黑水虻的生长发育情况。

1.2.2黑水虻国外研究进展

与此同时Biasato研究部分脱脂黑水虻幼虫粕对仔猪生长性能，营养物质消化率，血液形态，肠形态和组织学特征的影响。所得结果表明，部分脱脂的BSF幼虫粕可作为断奶仔猪日粮中的饲料成分，不会对其生长性能、营养物质消化率、血液成分产生负面影响，具有降低BSFL膳食水平的作用（P lt;0.05）。随着科学技术的不断进步，科学家不再仅仅局限于表观实验的数据，而是慢慢由实验室的人工培养慢慢发展到深层次的肠道细菌分子水平的探究。利用宏基因组技术^[7][8][9]对黑水虻的肠道细菌进行研究，一般来说首先从BSFL肠道中提取宏基因组DNA然后PCR扩增细菌16SrRNA，在这之后不同的科学家有着不同的测定比较方式，例如ERIC(肠杆菌基因间保守重复序列)-PCR指纹图谱技术，焦磷酸测序，以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法以及变性梯度凝胶电泳（DGGE）。科学家们应用这些技术逐步的从分子水平上找到了适合培养黑水虻环境条件以及培养条件，并且强化了黑水虻在处理餐厨垃圾和作为鸡、猪、鱼类的饲料上的作用^[10-12]，既有效处理了生活上的餐厨垃圾，又为其他物种提供了优良的食物来源^[13-15]。

1.3宏基因组技术

1.3.1概述

宏基因组的数据分析方法在大体上可以分为两大类^[8]：基于比对和基于序列特征的分析方法。基于比对的方法是以数据库作为参考,利用比对软件分析数据,方法的正确性依赖于数据库信息的完整程度。而序列特征直接提取于序列,是对基因组序列内部的组成和关联信息的深入挖掘^[19],可以特异地区别物种以及基因组中的功能原件。与第一种方法相比，由于不依赖于数据库的完整和准确，所以可以更加精准的进行宏基因的测序，对于研究对象多为位置菌群的宏基因组格外有效。而按照本实验的要求来看，更倾向于第一种方法，因为我们更多的是想知道菌种的类型，形态，理化指标，以及基本功能等数据，而非深入挖掘基因间的特异关系。

1.3.2当代宏基因技术的发展

1.3.2.1 LSH-SNN技术^[16]

Sawsan Kanj提出了一种新的算法来聚类高维序列数据及其在宏基因组学领域的应用，其目的是从环境站点采样的基因组混合物重建个体基因组，而无需事先了解参考数据（基因组）或簇的形状。由于当代序列数据集的尺寸过大，例如使用共享最近邻居（SNN）规则，这些问题通常不能直接用寻求估计聚类密度的经典方法来解决。我们在这里探索一种基于将SNN规则与局部敏感散列（LSH）的概念相结合的新方法。所提出的方法称为LSH-SNN，其通过将输入数据随机地分成较小尺寸的子集（桶）并在每个桶上采用SNN规则来工作。可以在共享足够数量的元素的邻居之间创建链接，因此允许从链接元素生成聚类。 LSH-SNN可以扩展到包含数百万个序列的更大数据集，同时在各种样本大小和复杂性上实现高精度。

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