论文总字数：17239字

摘 要

本课题利用酶促交联的手段，以改性聚氨基酸为主要实验材料，不额外添加交联剂等试剂，在温和条件下制备水凝胶，并且产物专一。同时测试了该水凝胶的粘附性、溶胀率、降解性能、生物相容性、流变等性能。

本实验以γ-聚谷氨酸（γ-PGA）为原料，活化侧基后，用盐酸多巴胺对其进行修饰，生成改性聚谷氨酸材料。凭借酪氨酸酶可氧化多巴变为多巴醌的特点，利用酪氨酸酶将改性γ-PGA的多巴胺残基氧化为醌，接着醌与醌发生偶联反应，最后生成水凝胶。与其他方法合成的水凝胶相比，酶促交联水凝胶反应条件温和易满足，生物相容性好,并且无需添加其他试剂，包括有毒的交联剂，无多余副产物，因此作为医用材料有广阔的应用前景。

关键词:水凝胶 酶促交联 γ-聚谷氨酸 生物相容性

Preparation and Characterization of Enzymatic-crosslinking Hydrogel Prepared from Amino Acids

Abstract

This paper uses polyamino acid as main experimental material to prepare the hydrogel by the method of enzymatic cross-linking, while under mild conditions without adding any reagents such as cross-linking agents, and the product is specific. In the meantime, we have also tested the tissue adhesion strength, swelling ratio, degradation ratio, biocompatibility and rheological evaluation of the hydrogel.

Poly（γ-glutamic acid）（γ-PGA）is used as the raw material in the experiment. After activating the side groups, it was modified with dopamine hydrochloride to form modified γ-PGA. Based on the characteristic that tyrosinase can oxidize DOPA to dopaquinone, the enzymatic cross-linking hydrogel was synthesized by coupling quinone and quinone after the dopamine residue of modified γ-PGA was oxidized to quinone by tyrosinase. Compare with synthesizing hydrogels by other methods, enzymatic cross-linking hydrogels have mild reaction conditions and good biocompatibility, no additional any other reagents like toxic cross-linking agents, and no excess by-products. So they have broad application prospects as medical materials.

Keywords: Hydrogel；Enzymatic cross-linking；Poly（γ-glutamic acid）；biocompatibility

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1 介绍 1

1.2γ-聚谷氨酸水凝胶 1

1.3水凝胶成胶方法 1

1.3.1物理交联法 1

1.3.2化学交联法 2

1.4交联用酶分类 3

1.4.1水解酶类 3

1.4.2转移酶类 3

1.4.3氧化还原酶类 3

1.4.4多酶联合反应 4

1.5酪氨酸酶（Tyrosinase） 4

1.7本课题的设计思路和研究内容 6

第二章 酶促交联水凝胶的制备 7

2.1实验设备 7

2.2实验试剂 8

2.3实验方法 8

2.3.1多巴胺修饰的γ-聚谷氨酸的制备 8

2.3.2水凝胶的制备 9

第三章 材料的表征 10

3.1γ-PGA的表征 10

3.2γ-PGA-DA的表征 10

第四章 水凝胶的性质测试 12

4.1凝胶化时间测试 12

4.2猪皮拉伸实验 12

4.3细胞相容性实验 13

4.4溶胀实验 13

4.5降解实验 14

4.6凝胶流变性质测试 15

第五章 结果与讨论 16

参考文献 17

致 谢 19

第一章 绪论

1.1 介绍

水凝胶是一类新型的高分子材料。水凝胶内含有大量的亲水基团，因此它可以吸收超过自身体积数十倍甚至数百倍的水，并且它有在水中会膨胀却不溶解的特性，因而具备良好的保水能力^[1]。其中，聚氨基酸水凝胶是一种具有良好生物相容性，易于降解的聚合物材料，具有蛋白质酰胺键等结构特征，可用于药物运输，组织工程，环境保护等领域。它是一种应用前景广阔的材料。其中，广泛使用的包括聚谷氨酸水凝胶，聚赖氨酸水凝胶等^[2]。

目前，水凝胶常用的制备方法^[3-7]大致有以下几种：物理交联法，化学交联法，光聚合交联法等^[8]，均可以使用在合成氨基酸水凝胶上。其中，酶法交联由于其高效、专一、活性可控、反应条件温和等特点越来越受到关注^[9]。

1.2 γ-聚谷氨酸水凝胶

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）水凝胶是由谷氨酸单体上-COOH及-NH2进行酰胺化反应，缩聚产生的一种水凝胶。由于谷氨酸分子上有许多个有反应活性的-COOH，具有很强的亲水性，因此交联形成的γ-PGA水凝胶具有十分优异的吸水能力，目前所制备的γ-PGA水凝胶，最高吸水倍率可达自身重量的五千倍，同时，γ-PGA水凝胶的生物相容性优异、降解率高，容易降解，可应用于组织工程、伤口敷料、静电纺丝等领域^[10]。如Xu等人^[11]受细胞外基质（ECM）环境的启发，开发了一种基于静电纺丝、光控交联的γ-聚谷氨酸/人参皂苷RG3（GS-RG3）多功能水凝胶纤维支架，用于组织修复和伤口治疗，为促进伤口愈合和组织再生提供了新的策略。

1.3水凝胶成胶方法

1.3.1物理交联法

水凝胶可以通过分子间作用力，如疏水作用、氢键、静电作用以及链间缠结等进行暂时性物理交联而形成，此方法制备的水凝胶没有使用交联剂，生物相容性好，但该过程一般为可逆的^[12]。比如，透明质酸溶液，在pH为2.5时，通过冷冻解冻法可制得具有粘弹性的类凝胶^[13]，冷冻解冻技术制备水凝胶的原理主要是：水溶液在低pH下的冷冻过程中，分子间的静电排斥力会受到压制，因此溶液分子能够紧密的排列在一起形成凝胶，但形成的凝胶很不稳定^[14]。后来，研究发现分子量是形成物理交联凝胶的关键因素，当其分子量低于200 KDa时，透明质酸溶液不能形成凝胶^[15]。有关研究表明，分子间氢键在物理水凝胶网状结构的形成过程中也起了重要作用。在成胶的分子链上引入其它长链分子，可以促进凝胶的形成，比如Pitarresi 课题组^[16]通过向透明质酸链上引入聚乳酸（PLA），并进一步引入聚乙二醇（PEG）链，使得透明质酸的支链增多，从而有利于分子间发生缠绕，可通过简单的物理混合就能形成水凝胶，并且此水凝胶能够粘附到假体的表面，向水凝胶中加入抗菌药物可用来治疗假体植入术后感染。

1.3.2化学交联法

化学交联法^[5-7,17-20]是目前用于合成生物材料研究最多，应用最广泛的方法，主要是由于它们可以轻松普遍地进行，而不需要专业技术或设备^[17]。比如Wang等人^[22]利用酪胺氯化氢在EDC / NHS的作用下形成活性酯，并且随后在氧化还原反应过程中产生苯氧基自由基的反应，在不需要额外控制条件的情况下，制备出氧气诱导的酪氨酸盐衍生物之间的无酶动态偶联水凝胶，制成的水凝胶具有超高的自愈合性能、优异的机械性能和粘合性能，因此在许多领域包括组织工程、伤口敷料、手术粘性绷带、软体机器人等场景中具有广泛的应用。除此之外，化学反应还有双官能或更高官能的交联剂可用于通过加成反应与亲水聚合物的官能团反应，光聚合交联，酶促交联等。下面重点介绍最后两种化学交联方法。

1. 光聚合交联法

光聚合交联法^[6-7,17-18]也是化学交联法中的一部分。在紫外光照射下（或可见光，取决于对波长的选择），含有或修饰有光敏性基团的反应性底物，通过分子内或者分子间交联，形成三维网络水凝胶。光聚合作为水凝胶制备的一种有效方法，反应的条件比较温和，过程条件可以控制，副产物较少。与其它交联方法相比，光交联法制备的水凝胶具有如下优点：（i）可通过打开和关闭灯光轻松控制水凝胶的合成与否，同样的也可以根据精确调节的光照剂量实现功能可调性；（ii）可使凝胶的前驱体溶液实现原位交联；（iii）在室温或生理温度下就可以快速聚合形成水凝胶；（iv）产物几何形状易控制；（v）设置特定波长可针对不同生物过程的进行独立的空间或时间控制等。这些优点使其在药物控释、生物传感介质、3D组织工程构建体等领域得到广泛应用。

1. 酶促交联法

酶是一种生物催化剂，由活细胞产生的具有催化功能的、活性可调的蛋白质。酶促交联^[9,16,21]是以酶作为催化剂的化学反应，酶具有催化能力极强、选择性高、反应条件温和的特点^[23]，其本身的降解产物为氨基酸，具有良好的生物相容性。目前在酶促交联制备的水凝胶中使用较多的是辣根过氧化酶（HRP），在过氧化氢存在的条件下，通过氧化偶联苯酚制得水凝胶。一般方法制备水凝胶会使用交联剂，不易除净，对材料质量也有影响。利用酶促交联的方法形成高分子水凝胶除了可以使反应高效专一地进行以外，还剔除了有毒交联剂的负面影响，降低了凝胶的生产成本，使其优势更加明显，制备出的聚氨基酸类水凝胶在实际生产中将会得到更为广泛的应用。因此本课题选用酶促交联法合成氨基酸水凝胶。旨在更大程度上提升材料的生物相容性。

1.4交联用酶分类

根据不同酶催化的反应性质的不同，可将其分成六大类：氧化还原酶类，转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类^[21]。这中间用于生成高分子聚合物的大多为水解酶类，转移酶类，以及氧化还原酶类，下面对这三种酶进行详细介绍。

1.4.1水解酶类

水解酶类是是一类催化水解反应的酶，也可以说它们是一类特殊的转移酶。其中脂肪酶可能是最早用于形成高分子的酶类。Sym早在1936年就利用脂肪酶来合成聚酯^[24]。别的水解酶类也可用来催化反应聚合，如Toledano等人^[25]利用嗜热菌蛋白酶进行逆反应，使肽链进行自组织成胶等。

1.4.2转移酶类

转移酶类是是一类能够催化除了氢以外，其他化学官能团从一种底物转移到另一种底物的酶类。可用于催化聚合高分子链的转移酶包括转谷氨酰胺酶（TG）、激酶等。如Westhaus等人^[26]利用TGase依赖Ca2 的特点，将CaCl2包埋在热触发脂质体中，当加热到37℃后，脂质体会释放超过90%的Ca2 ,诱导多糖和蛋白质水凝胶的快速凝胶化，而在37℃以下室温可保存数天。这种方法可用于快速凝胶化可注射的生物材料，其可在室温下储存，并以微创方式注射到身体组织或腔中，在其上快速固化。

1.4.3氧化还原酶类

氧化还原酶类是一类催化氧化还原反应的酶，可分为氧化酶和脱氢酶两类^[27]。近年来，氧化还原酶占据了大部分的酶促交联反应用酶，包括辣根过氧化物酶（HRP）、漆酶（Laccase）、大豆过氧化物酶（SBP）、葡萄糖氧化酶（GOX）、酪氨酸酶（Tyrosinase）等^[28]。如Su等人^[29]使用HRP，制备出以自由基聚合为主的坚韧的多功能纳米复合水凝胶；Dulong等人^[30]使用漆酶，以阿魏酸化学接枝的多糖为主要原料，获得具有可控接枝度及机械性能的天然水凝胶。其中酪氨酸酶也因为其优异的性能和广泛的应用范围越来越受到关注。Kim等人^[31]利用酪氨酸酶制备出可注射，可喷雾的快速成型水凝胶，可作为组织粘合剂，在医学领域有极大的应用前景。Kang等人^[32]利用酪氨酸酶将丝素蛋白（SF）与壳聚糖（CS）偶联制备出一种丝素蛋白水凝胶，在纺织材料及生物医学材料中都具备合适的应用场所。

1.4.4多酶联合反应

近段时间，在使用酶促交联反应成胶的研究中，往往会使用两种甚至以上种类的酶来满足不同的应用场所和需求。比如Wei等人^[33]采用双酶介导的氧化还原体系，利用GOx / HRP两种酶的协同作用，来制备坚韧的杂化水凝胶，最后达到自组装交联聚合的目的。所得杂化水凝胶结合了超分子水凝胶与聚合物水凝胶的优点，可获得更高的机械强度和多孔网络，也保持了高重复使用性和热稳定性。同时，因为使用了酶促体系，因此该杂化水凝胶同时具备可生物降解性与极高的生物相容性，因此可应用于原位3D打印制造生物相关应用（例如生物催化和组织工程）的有前途的支架。这种仿生方法为设计和构建生物材料提供了新的途径。在单一酶使用受限的情况下，使用多酶联合反应不失为一种有效的解决途径。

1.5酪氨酸酶（Tyrosinase）^[34-35]

酪氨酸酶是一种结合铜的金属酶，酪氨酸酶的主要功能之一是参与动植物中的黑色素形成^[34]。其主要参与两个周期的反应：在第一周期中，在氧气存在下，酪氨酸酶在通过四种酶状态（E_deoxy，E_oxy，E_oxy-M和E_met-D）完成单酚的氧化; 在第二周期中，通过五种酶状态（E_deoxy, E_oxy, E_oxy-D, E_met和 E_met-D），最后把邻二酚氧化。这两个周期导致邻醌的形成，醌再经过不同的反应，最后形成黑色素。如图1-1所示。反应中被氧化的醌同时也是反应性的，可以与各种亲核试剂进行非酶反应，比如可与胺、巯基、咪唑和其他醌基偶联。在真菌中，黑色素的作用与生殖器官的分化和孢子的形成、病原真菌的毒力以及损伤后的组织保护有关。

酪氨酸酶的一个特征是因为单酚酶活性而导致的典型时间滞后。酪氨酸酶对单羟基酚的羟基化如下：2单羟基酚 O ₂ AH ₂ →2邻苯二酚 H ₂ O A，其中AH ₂为还原剂。酪氨酸酶在其活性中心具有两个独立的结合位点，一个用于底物（单羟基苯酚），另一个用于还原剂（邻苯二酚或外源添加的AH ₂）。当不加入外源AH ₂时，羟基化反应具有滞后期，这是为了获得相对稳定的二酚浓度，体现出的稳态酶和化学步骤之间的动态平衡。要达到这样的浓度，少量的酶必须以氧化态的形式存在。滞后期是一种自催化机制，对于以酪氨酸作为底物，由酪氨酸酶催化的反应，依赖于多巴的产生过程。外源添加还原剂（如抗坏血酸盐，羟胺和对苯二酚）也可以缩短滞后期，但不如邻苯二酚有效。此外，滞后取决于各种因素，例如底物和酶的浓度，酶源，培养基的pH，氢供体如L-多巴或其他儿茶酚和过渡金属离子的存在等。

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