论文总字数：15191字

摘 要

通过查找文献对葡聚糖蔗糖酶，大肠杆菌有了初步的了解。并以此来考虑哪些因素会影响到重组菌的生长，以及在那种培养条件会是最佳。同时查出果糖标准曲线作为对照，来显现实验结果是否与预料符合，以及偏差程度和如何改变条件。

葡聚糖蔗糖酶是一种转糖苷酶，在合成糖衍生物被广泛应用。这种酶作为聚糖转化的关键酶，在许多工业领域都有着重要作用将其此基因重组导入大肠杆菌中，并在最适条件下使其表达出来便是我们要探究的实验课题。在此次试验中，利用实验室已有的大肠杆菌DNA作为质粒。将目的基因导入之后，培养重组大肠杆菌。并设置不同的培养条件。如改变培养温度，培养时间，IPTG浓度，以及酶催化下的pH，温度等等。通过实验得到的结果发现当培养温度在21摄氏度，培养时间在26h，IPTG浓度在0.1时酶活性最高，在酶催化下反应体系pH为6左右，温度为30℃是酶活性最高。因此此条件下为酶最适生长条件。

关键词：果糖；葡聚糖蔗糖酶；多聚糖；大肠杆菌

Abstract

A preliminary understanding of dextran sucrase and Escherichia coli was given. In order to consider which factors will affect the growth of recombinant bacteria, and in which culture conditions will be the best. At the same time, the fructose standard curve was found out as a control to show whether the experimental results were in good agreement with the expected results, as well as the degree of deviation and how to change the conditions. Glucan sucrase is a transglycosidase, which is widely used in the synthesis of sugar derivatives. This enzyme, as the key enzyme of glycan transformation, plays an important role in many industrial fields to recombine this gene into E. coli and express it under the optimum conditions. It is the experimental subject that we want to explore. In this experiment, E. coli DNA was used as plasmid. After the target gene was introduced into E. coli, the recombinant Escherichia coli was cultured. Different culture conditions were set up. Such as changing culture temperature, culture time, IPTG concentration, pH, temperature catalyzed by enzyme and so on. The results showed that when the culture temperature was 21 degrees Celsius and the culture time was 26 h, the enzyme activity was the highest when the concentration of IPTG was 0.1. The pH of the reaction system was about 6 and the temperature was 30 ℃. Therefore, this condition is the most suitable condition for enzyme growth.

Key words: fructose ;glucan sucrase; polysaccharide ;Escherichia coli

目录

第一章 文献综述 1

1.1自然界中的多聚糖 1

1.2 聚糖发展方向 1

1.3 GH70家族 2

1.4葡聚糖蔗糖酶的简介 3

1.5 葡聚糖的简介 4

1.6大肠杆菌的作用 4

第二章 材料和方法 6

2.1实验材料 6

2.1.1 菌种与质粒 6

2.1.2 工具酶 6

2.1.3实验试剂 6

2.1.4实验仪器 7

2.1.5培养基配方及缓冲液配置 7

2.2实验方法 8

2.2.1引物设计 8

2.2.2 聚合酶链式反应（PCR） 扩增 DSR-M△2 基因 8

2.2.3 PCR 产物的回收 9

2.2.4 酶切 9

2.2.6连接 10

2.2.7 质粒的转化 10

2.2.8质粒测序 11

2.2.9大肠杆菌产葡聚糖蔗糖酶的诱导条件优化 11

2.2.10 酶活测定方法 12

第三章 结果与讨论 13

3.1重组质粒pET28a( )-DSR-M△2 的酶切鉴定图 13

3.2 重组质粒pET28a( )-DSR-M△2 蛋白电泳图 14

3.3 IPTG浓度对大肠杆菌产酶的影响 15

3.4培养时间对大肠杆菌产酶的影响 15

3.5培养温度对大肠杆菌产酶的影响 16

3.6酶活反应体系pH对大肠杆菌产酶的影响 17

3.7酶活反应体系反应温度对大肠杆菌产酶的影响 18

第四章 结论与展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献………………………………………………………………………………………20

第一章 文献综述

1.1自然界中的多聚糖

从丰富的低成本原料中提取的可生物降解的、可生物相容性的多糖，在不同的研究领域有着越来越广泛的应用前景。这类多糖具有显著的多样性，其中许多在金属阳离子应用领域的潜力实际上尚未被开发.即对带负电荷的研究,用于金属阳离子相关应用的硫酸多糖是稀缺的。在这些多糖的结构中，O-SO3-基团的存在为它们提供了永久的负焦^[1]。GED点甚至在pH值低至2的情况下，硫酸盐与附着在生物聚合物骨架上的其他附近功能之间的最终协同性预示着生物聚合物的强结合模式。DS阳离子物种具有不同的选择性，与最常研究的多糖有关联。可能是硫酸多糖开发不足的主要原因，硫酸软骨素(CS)和岩藻糖(FD)等水溶性多糖的共价固定和网状化程序的缺乏。植物的器官组织中多糖是最丰富的成分。根据它们在植物中的作用，它们可分为两大类。可以被称为D形成细胞壁。而能够作为能量和水的主要来源的聚合物在许多植物器官被归类为储存多糖。在A.vera gEL有两种主要的多糖类型：富含甘露聚糖的贮藏多糖和果胶物质，它们是细胞壁的主要成分^[2]。大部分储存多糖位于细胞内，即淀粉，尽管在某些情况下，细胞壁上的半纤维素多糖(主要是甘露聚糖)可能会充当食物再分配。在百合科和虹膜科的大多数成员中，葡甘聚糖已被确定为主要的贮藏多糖。葡萄糖(GLC)和甘露糖(MAN)的定量残基，连接在β-(1→4)骨架上，侧链含有少量半乳糖残基。在芦荟植物中L被认为是一种贮水组织，是甘露聚糖中的主要多糖^[3]。该聚合物是目前研究最广泛的A.VERA，由β1-4连锁甘露糖残基组成。

1.2 聚糖发展方向

迄今，即使只对棄糖的主要类别的进化做出比较全面的表述，现有资料显然不够充分^[4]。但还是有理由提出，在复杂的多细胞生物体里，聚糖的多样性是由进化中来自内源和外源的进化选择压力驱动产生的。假定外源性病原体的进化较快，有可能，脊椎动物的聚糖结构的多样性是由病原体介导的选择过程衍生而来的。很明显，在完整动物中，完成更多的基因破坏将对区别内源性和外源性的聚糖功能有所裨益。由于在不同的物种之间的同一类型的细胞上相同结构的固定表达可意味着其重要的内源性功能，所以更为系统的比较糖生物学研究对于预测内源聚糖的功能是有帮助的^[5]。这样的工作也有助于确定进化中寡糖多样化的速率，更好的确定外源性和内源性的选择压力的相对作用，最终使对进化中聚糖多样性的功能意义有更好的了解。

1.3 GH70家族

GH70酶是由来自例如链球菌，明串珠菌，乳酸杆菌属于乳酸菌产生的转葡糖基酶。它们与GH13和GH77酶家族一起形成了GH-H 氏族。

该家族中分类的大多数酶使用蔗糖作为D-吡喃葡萄糖基供体来合成高分子量（gt; 10 6 Da）的α-D-葡聚糖，同时释放D-果糖。它们也被称为葡糖（GTF）或葡聚糖蔗糖酶（GS）。从肠膜明串菌株的蔗糖肉汤培养物中分离出第一种葡聚糖蔗糖酶 。该酶显示出仅从蔗糖合成水溶性葡聚糖（α-1,6连接的D-葡聚糖）^[6]。来自肠膜明串菌株的葡聚糖，是第一种商业化并用于制药和精细化学应用的微生物多糖。

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