论文总字数：18412字

摘 要

β-半乳糖苷酶（乳糖酶）属于糖苷水解酶，能够水解半乳糖苷键，使乳糖转化为半乳糖和葡萄糖，在工业上有着广泛的应用。本研究从Caldicellulosiruptor kristjanssonii得到β-半乳糖苷酶基因bgal，并将其导入到载体pET-22b中，构建了重组质粒pET22b-Ck bgal，并对其诱导表达，随后对其酶学性质进行了研究。

β-半乳糖苷酶的蛋白大小约为49.74 KDa，最适反应温度60℃，60℃以下热稳定性良好，最适pH约在5.0到6.0之间。

另外，通过向反应体系中加入不同金属离子，以此探究它们对β-半乳糖苷酶酶活的影响。结果发现Na 和Mn² 对酶起促进作用，Zn² 、Fe² 、Fe³ 有抑制作用，Cu² 则能够使酶基本失活。

关键字：半乳糖苷酶 Caldicellulosiruptor kristjanssonii 重组表达 bgal 酶学性质

Cloning, expression and enzymatic characterization of a beta-galactosidase from Caldicellulosiruptor kristjanssonii

Abstract

The beta-galactosidase (lactase) is one of the glycoside hydrolase, which can catalyze the hydrolysis of galactoside bonds and convert lactose into galactose and glucose. It has been used in industry widely. In this study, a recombinant plasmid pET22b-Ck Bgal was constructed from Caldicellulosiruptor kristjanssonii and introduced into vector pET-22b. Try to induced and express ,then learn the enzymatic properties of the recombinant plasmid pET22b-Ckbgal .

The protein size of beta-galactosidase is about 49.74 KDa, 60℃ is its optimum reaction temperature and l find that ,under the 60℃,It's very stable. The best pH is between 5.0 and 6.0.

ln addition, l added different metal ions into the reaction system to see the effects on the activity of the beta-galactosidase. The result is that Na and Mn² can improve the activity of the enzyme, and Zn² , Fe² , Fe³ will hold up it, while Cu² could kill the enzyme basically.

Key words: Galactosidase；Caldicellulosiruptor kristjanssonii；Recombinant expression；bgal；Enzymatic properties

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1β-半乳糖苷酶简介 1

1.2β-半乳糖苷酶来源 1

1.3β-半乳糖苷酶的分类 2

1.4β-半乳糖苷酶的基础性质 2

1.5β-半乳糖苷酶作用机理 2

1.6β-半乳糖苷酶的应用 3

1.6.1 食品工业 3

1.6.2 医疗领域 3

1.6.3 免疫与检测方面的应用 3

1.6.4 环保领域 4

1.6.5 果蔬软化方面的应用 4

1.7本研究目的与意义 4

第二章 材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1实验仪器 5

2.1.2实验试剂 6

2.1.3菌株与载体 7

2.1.4培养基 7

2.2实验方法 7

2.2.1 CK bgal基因的获取 7

2.2.2 重组质粒的构建与鉴定 8

2.2.3 重组蛋白的诱导表达 8

2.2.4 重组蛋白的SDS-PAGE检测 9

2.2.5蛋白浓度测定 10

2.2.6 重组蛋白的纯化 10

2.2.7 重组蛋白的酶活检测 10

2.3 β-半乳糖苷酶酶学性质测定 11

2.3.1 最适反应温度与热稳定性的测定 11

2.3.2 测定最适反应pH 11

2.3.3 金属离子对酶活性的影响 11

第三章 结果与讨论 12

3.1 重组质粒的构建和筛选 12

3.1.1 CK bgal目的基因的获取 12

3.1.2 载体和基因双酶切 12

3.2重组蛋白的原核表达与纯化 13

3.2.1重组蛋白的表达 13

3.2.2重组蛋白的纯化 14

3.3β-半乳糖苷酶的酶学性质 14

3.3.1 最适温度与热稳定性 14

3.3.2 最适pH 15

3.3.3 金属离子对β-半乳糖苷酶的影响 16

第四章 结论与展望 17

4.1结论 17

4.2展望 17

参考文献 18

致谢 21

文献综述

1.1β-半乳糖苷酶简介

糖苷水解酶（Glycoside hydrolases, GH）是一类通过水解碳水化合物中糖苷键，以此降解碳水化合物的酶类，该酶类在再生能源生产、果汁风味工业生产以及具有医疗价值的低聚寡糖的生产等方面应用前景广泛，因此人们正在致力于寻找具有高活力、性质优良的糖苷水解酶类[1]。

β-半乳糖苷酶又叫乳糖酶或β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，属于糖苷水解酶，能够转化半乳糖苷，是一种能够将乳制品中的乳糖分子催化水解为葡萄糖和半乳糖的酶[2]。由于β-半乳糖苷酶对乳糖的优秀的催化作用，因此其在食品工业中有着广泛地应用，尤其是在乳制品的加工生产过程中[3]。

图1.1β-D-半乳糖苷半乳糖的水解

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