论文总字数：21939字

摘 要

传统化学法催化羧酸到醛的还原反应，不仅需要贵金属作为催化剂，而且存在反应条件极端、对相邻官能团的耐受性差、产生副反应等缺点。而生物合成法催化羧酸到醛以羧酸还原酶为核心，其具有温和的反应条件、广泛的底物谱，并且能够专一性识别羧酸基团，反应针对性强，可以解决化学合成法带来的环保问题和能源浪费，大大降低生产过程中能源与资源的消耗。ATP则是羧酸还原酶将羧酸还原成各自的醛的过程中的重要辅助因子。本课题拟利用一种多聚磷酸激酶实现ATP基于AMP的再生，并构建羧酸还原酶与多聚磷酸激酶耦联的催化体系。

关键词：羧酸还原酶 多聚磷酸激酶 多酶耦联 ATP再生

Construction of Catalytic System Coupled with Carboxylic Acid Reductase and Polyphosphoric Acid Kinase

Abstract

The conventional chemical method catalyzing the reduction reaction of a carboxylic acid to an aldehyde not only requires a noble metal as a catalyst, but also has disadvantages such as extreme reaction conditions, poor resistance to adjacent functional groups and side reactions. In contrast, the biosynthesis method catalyzing the carboxylic acid to aldehyde with carboxylic acid reductase as the core has mild reaction conditions and extensive substrate spectrum, can uniquely identify the carboxylic acid group, and the reaction is highly targeted. It can solve the environmental problems and energy waste of chemical synthesis method and greatly reduced the consumption of energy and resources in the process of production. ATP is an important cofactor in the process of carboxylic acid reductase to reduce carboxylic acids to their respective aldehydes. This study aims to use a polyphosphate kinase to achieve ATP-based AMP regeneration and to construct a catalytic system coupled with carboxylic acid reductase and polyphosphate kinase.

Key Words: Carboxylic acid reductase; Polyphosphate kinase; Multi-enzyme coupling; ATP regeneration

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 羧酸还原酶 1

1.1.1 羧酸还原酶概述 1

1.1.2 羧酸还原酶的广泛底物谱 1

1.1.3 羧酸还原酶的催化反应 1

1.1.4 羧酸还原酶的应用 1

1.2 多聚磷酸激酶 2

1.2.1 多聚磷酸激酶概述 2

1.2.2 多聚磷酸激酶分类 2

1.2.3 多聚磷酸酶的应用 2

1.3 多酶耦联体系 3

1.3.1 多酶耦联概述 3

1.3.2 多酶耦联体系分类 3

1.3.3 ATP再生 3

1.3.4 多酶耦联体系的优缺点 4

1.3.5 多酶耦联体系的应用 4

1.4 羧酸还原酶与多聚磷酸激酶耦联体系 4

1.4.1 本实验研究背景 4

1.2 本实验的目的及意义 5

1.3 本实验研究思路及研究方法 5

第二章 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株与质粒 7

2.1.2 培养基 7

2.1.3 试剂盒及工具酶 7

2.1.4 实验试剂 7

2.2实验仪器与设备 9

2.3 感受态细胞的制备 9

2.4 重组菌的构建 10

2.5 重组酶的诱导表达 12

2.6 SDS-PAGE检测 12

2.7 双酶耦联催化 12

2.8 分析方法 13

第三章 结果与讨论 15

3.1 重组菌的构建 15

3.1.1 表达载体pETDuet-car、pETDuet-car-sfp的构建与鉴定 15

3.1.2 表达载体pETDuet-car、pETDuet-car-sfp的转化和酶切验证 15

3.2 羧酸还原酶的诱导表达 16

3.3 重组酶的纯化与酶活测定 18

3.3.1 重组酶的纯化 18

3.3.2 重组酶的酶活测定 20

3.4 双酶耦联催化体系的建立 21

第四章 结论与展望 23

4.1 实验结论 23

4.2 展望 23

参考文献 25

致谢 28

第一章 文献综述

1.1 羧酸还原酶

1.1.1 羧酸还原酶概述

羧酸还原酶（Carboxylic acid reductase，CAR）广泛存在于细菌、真菌及植物中，世界上第一个羧酸还原酶(NcCAR)于19世纪70年代在Neurospora crassa中被发现[1]。羧酸还原酶可催化羧酸还原为相应的醛，在此过程中消耗ATP，并以NADPH为氢电子供体[2]。来自分枝杆菌的羧酸还原酶可将多种脂肪酸（C₆-C₁₈）转化为相应的醛，并与醛还原酶或醛脱碳酶一起转化为脂肪醇（C₆-C₁₈）或脂肪烃（C₇-C₁₅）。有研究发现一种来自Marinobacter aquaeolei VT8的脂酰还原酶不需要醛还原酶，只需要依靠电子传递即可将底物范围为C_8:0到C_20:4的脂肪酰还原为脂肪醇[3]。

1.1.2 羧酸还原酶的广泛底物谱

羧酸还原酶可以转化许多种底物，包括脂肪酸、芳香族酸、多环酸和杂环酸。来自不同物种的羧酸还原酶的底物谱大多是交叉的，但也有例外，如来自Segniliparus rotundus的SrCAR是唯一可以还原硝基苯甲酸衍生物的羧酸还原酶[4]。

1.1.3 羧酸还原酶的催化反应

羧酸还原酶的酶催化中心具有4'-磷酸泛酰巯基乙胺的辅基，该辅基可以通过磷酸二酯键与丝氨酸残基进行共价连接[5]。羧酸还原酶催化反应的反应机理涉及三个关键步骤：（1）脂肪酸底物腺苷酰化形成AMP-脂酰基复合物；（2）在脂酰基部分和磷酸泛酰巯基乙胺辅基之间形成硫酯键；（3）硫酯中间体还原为醛。另外，M. Kalim Akhtar等人研究发现，sfp与car基因同时整合可以提高羧酸还原酶的活性[5]。Padmesh Venkitasubramanian等人研究发现来自Nocardia的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（PPTase）与羧酸还原酶共表达可以使羧酸还原酶的比活力提高20倍[6]。在体外，羧酸还原酶的活性被副产物焦磷酸盐所抑制，无机焦磷酸酶（Ppa_Ec）与羧酸还原酶共表达可以充分提升反应速率和醛的产量[7]。

1.1.4 羧酸还原酶的应用

羧酸还原酶具有多种应用途径。（1）转化羧酸为相应的醛，如利用NiCAR（来自Nocardia iowensis）与三个同源基因构建的菌株生产香草醛；（2）转化羧酸为醇和烷烃，如MmCAR（来自Mycobacterium marinum）与醛还原酶基因构建的大肠杆菌BL21(DE3)菌株用于生产醇和烷烃；（3）转化羧酸为哌啶和吡咯烷，如一锅法制备哌啶、吡咯烷，一次性加入CAR、ω-转氨酶(ω-TA)和亚胺还原酶，使酮酸或酮醛还原为单或双取代的手性哌啶或吡咯烷；（4）转化羧酸合成药物，如天麻素、抗氧化剂等[1]。

1.2 多聚磷酸激酶

1.2.1 多聚磷酸激酶概述

多聚磷酸（polyP）是由高能磷酸键连接多个磷酸基团组成的多聚体[8]。多聚磷酸激酶（Polyphosphate kinase，PPK）可以催化polyP_n-1 polyP_n的反应 ，其存在于多种细菌中[9]。

1.2.2 多聚磷酸激酶分类

目前发现的多聚磷酸激酶分为两类：（1）PPK1：催化ATP polyP_n-1 ADP polyP_n的反应。Kei Motomura等人发现好氧异养硝化细菌的PPK1催化ATP生成ADP的反应不可逆[10]。（2）PPK2：催化ATP polyP_n-1 ADP polyP_n和GTP polyP_n-1 GDP polyP_n的反应，其逆反应速率远大于正反应速率[8]。大多数PPK2具有一个氨基酸结构域，称为1-domain PPK2，而少数含有两个同源结构域，称为2-domain PPK2。PPK2又可被分为三个家族：Class I、Class II和Class III。Class I：属于1-domain PPK2，催化核苷二磷酸的磷酸化；Class II：属于2-domain PPK2，催化核苷单磷酸的磷酸化；Class III：属于1-domain PPK2，催化核苷单磷酸、核苷二磷酸的磷酸化[10]。

另外，在盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）的突变株中发现PPK3，PPK3被认为与细胞迁移有关；在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中发现PPK4，这丰富了PPK的研究[9]。

1.2.3 多聚磷酸酶的应用

polyP参与生物体中的许多代谢与调节，包括有丝分裂、基因转录等，而PPK是合成polyP必不可少的酶，所以在许多致病菌中，polyP和PPK关系到其生长，比如海分枝杆菌（Mycobacterium marine）[11]。尤其是在可以导致结核病的结合分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）中，PPK和polyP为结核病的治疗打开了通路[12]。另外，在强化生物除磷系统( Enhanced Biological Phosphorus Removel，EBPR)中，混合微生物群通过聚磷作用，可改善污水中的磷元素过剩。所以，研究关于PPK和PPX（多聚磷酸盐酯酶）的基因工程菌对污水处理有重大意义[13]。

1.3 多酶耦联体系

1.3.1 多酶耦联概述

近年来，合成生物学的思想成为了一项新的热门研究领域，其主要思想为从头构建人工生命体。与生物体内代谢的天然多酶体系不同，无细胞的合成生物体系需要构建体外多酶耦联催化体系从而实现与天然生物相同的代谢功能[14]。多酶体系依靠多种酶之间的相互作用，从而达到反应的高效与协同。

1.3.2 多酶耦联体系分类

多酶耦联体系主要分为自耦联催化体系和种间耦联催化体系[15]。自耦联催化体系依赖同一个微生物体内自有的多种酶实现，而种间耦联反应体系则是在不同种类的微生物中进行的。种间耦联催化体系又可分为：（1）辅因子再生体系：ATP和NADPH再生（利用脱氢酶）；和（2）底物耦联催化体系：可利用多种化合物为底物，以一种酶催化底物得到反应的中间体，再以另一种酶催化反应中间体得到目标产物[15]。

1.3.3 ATP再生

ATP是生命的能量货币，但其价格高，在许多辅因子依赖型反应中，为了更加经济，ATP再生系统成为了首选[16]。

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