论文总字数：19873字

摘 要

丙酮酸作为生物体代谢的重要中间产物，其浓度在一定程度上可以反映菌株的生理生长状态。因此，对丙酮酸浓度的快速实时监测对生物发酵生产过程和科学研究来说有非常大的指导作用和经济效益。相比于其他传统测定手段，酶生物传感器具有操作简单、快速高效的特点。现有的丙酮酸氧化酶传感器多以绿色气球菌来源为主。本研究从酶源入手，利用重组大肠杆菌异源表达不同微生物来源丙酮酸氧化酶，为丙酮酸氧化酶传感器的开发提供性能优异的丙酮酸氧化酶，旨在打破目前丙酮酸氧化酶种类单一、检测困难的现状。

本论文异源表达重组大肠杆菌分别成功获得9.0 U/mg的植物乳杆菌来源丙酮酸氧化酶（LpPyox）和42.1 U/mg的绿色气球菌来源丙酮酸氧化酶（AvPyox）。LpPyox最适pH为6.8，最适温度为40℃。AvPyox最适pH为6.8，最适温度为39℃。LpPyox对温度的耐受性优于AvPyox，且不依赖于辅因子TPP。AvPyox：TPP为1：2.5的滴定量时，AvPyox的催化性能最佳。分别构建了基于LpPyox和AvPyox的生物传感器，灵敏度为0.174 μA·cm^-2·mM^-1和0.403 μA·cm^-2·mM^-1。

关键词： 丙酮酸氧化酶 酶学性质 绿色气球菌 植物乳杆菌 生物传感器

Enzymatic Properties of Pyruvate Oxidase from Different Sources and Construction of Biosensors based on Pyruvate Oxidase

Abstract

Pyruvic acid is an important intermediate in the metabolism. Its concentration can show the physiological growth state of the strain in some degree. Rapid real-time monitoring of pyruvic acid concentration has great guiding and economic benefits for fermentation and scientific research. Compared to other traditional assays, enzyme biosensors are simple and efficient, but there are still some problems such as unstable enzyme activity. Now most of the pyruvate oxidase (Pyox) in biosensors are from Aerococcus viridans. In this study, pyruvate oxidase was heterologously expressed by recombinant Escherichia coli (E.coli) from different sources, in order to provide pyruvate oxidase with excellent performance for biosensor and break the current situation of the single type of pyruvate oxidase and difficult detection.

9.0 U/mg Pyox from Lactobacillus plantarum (LpPyox) and 42.1 U/mg Pyox from Aerococcus viridans (AvPyox) were successfully obtained by heterologous expression. The optimal pH of LpPyox and AvPyox was 6.8, and the optimum temperatures were 40℃ and 39℃, respectively. LpPyox was more tolerant to temperature and does not rely on the co-factor TPP. AvPyox had the highest enzyme activity when mixed with 2.5 times TPP. Biosensors based on LpPyox and AvPyox were constructed. The sensitivities were 0.174 μA·cm^-2·mM^-1 and 0.403 μA·cm^-2·mM^-1, respectively. The biosensor based on AvPyox responded well to the substrate, sodium pyruvate.

Keywords: pyruvate oxidase; enzymatic properties; Lactobacillus plantarum; Aerococcus viridans; biosensor

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1丙酮酸 1

1.1.1丙酮酸简介 1

1.1.2丙酮酸检测意义 1

1.1.3丙酮酸检测方法 2

1.2丙酮酸氧化酶 3

1.2.1丙酮酸氧化酶简介 3

1.2.2 丙酮酸氧化酶的应用 4

1.3酶生物传感器 4

1.3.1生物传感器 4

1.3.2酶传感器 5

1.3.3酶传感器的应用 5

1.4研究课题的意义与内容 6

1.4.1研究意义 6

1.4.2研究内容 7

第二章 材料与方法 8

2.1 实验材料 8

2.1.1主要实验试剂 8

2.1.2主要实验仪器 9

2.1.3培养基和部分溶液配制 9

2.2 实验方法 11

2.2.1 LpPyox基因的克隆 11

2.2.2丙酮酸氧化酶的表达与纯化 14

2.2.3丙酮酸氧化酶的酶活检测 14

2.2.4丙酮酸氧化酶的酶学性质测定 16

2.2.5丙酮酸氧化酶的电化学表征 17

第三章 结果与讨论 18

3.1丙酮酸氧化酶基因的克隆与表达 18

3.1.1 LpPyox基因的克隆 18

3.1.2丙酮酸氧化酶的纯化 19

3.2不同来源丙酮酸氧化酶的酶学性质测试 20

3.2.1 丙酮酸氧化酶的最适温度和温度耐受性测试 20

3.2.2丙酮酸氧化酶的最适pH和pH耐受性测试 21

3.2.3丙酮酸氧化酶的辅因子需求度测试 22

3.3丙酮酸氧化酶在电极上的表征 23

第四章 结论与展望 24

4.1结论 24

4.2展望 24

参考文献 25

致谢 27

文献综述

1.1丙酮酸

1.1.1丙酮酸简介

丙酮酸（Pyruvic acid）别名乙酰甲酸，α -酮酸之一。丙酮酸作为细菌菌体代谢的中间产物，参与糖酵解、三羧酸循环（TCA）、乳酸发酵等重要代谢途径，可以实现糖、脂肪和氨基酸三大物质的相互转化，天然出现在薄荷和蔗糖发酵液中。分子结构如图1所示。

图1.丙酮酸分子结构

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