论文总字数：16884字

摘 要

木糖酸脱水酶参与了很多代谢途径，也是很多生物合成途径中的重要酶。研究发现，木糖酸脱水酶有不同的菌株来源，不同菌种的脱水酶性质可能有较大的差别。木糖酸脱水酶对微生物发酵生产化学品的产量和质量等指标有重要影响，所以了解它的相应的性质可以提高生物转化的效率。

本文建立木糖酸脱水酶的高通量筛选方法，构建了1000-2000的突变库，通过充分对比之后从中选择了91号与96号，这两种相比于其他菌株突变效果更为显著，通过催化反应12h后，91号菌株和96号菌株的木糖酸的消耗量分别为4.2 g/L、4.8 g/L，且分别是未突变菌株的2.1和2.4倍。

关键词：木糖酸脱水酶 易错PCR 高通量筛选

Study on the Directional Modification of Xylose Dehydratase

Abstract

Xylose dehydratase is involved in many metabolic pathways and is an important enzyme in many biosynthetic pathways. The study found that xylose dehydratase can be obtained from many kinds of strains, and the difference in strain types directly determines the difference in their properties. Xylose dehydratase has an important influence on the yield and quality of microbial fermentation production chemicals, so understanding its corresponding properties can accelerate the efficiency of biotransformation.

In this paper, a high-throughput screening method for xylose dehydratase was established, and a 1000-2000 mutant library was constructed. After sufficient comparison, 91 and 96 were selected, and the two mutants were more effective than other strains, and were placed in 33℃. After 12 h of transformation, the consumption of xylenic acid of strains 91 and 96 was 4.2 g/L and 4.8 g/L, respectively, and was 2.1 and 2.4 times, respectively, of the unmutated strain.

Key Words: xylose dehydratase；Error-prone PCR ；High-throughput screening

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 木糖酸脱水酶 1

1.1.1 木糖酸脱水酶简介 1

1.1.2 木糖酸脱水酶的应用 1

1.2 木糖酸 2

1.2.1 木糖酸介绍 2

1.2.2 木糖酸的应用 2

1.3 定向进化 3

1.3.1 定向进化的研究进展 3

1.3.2 定向进化的策略 4

1.4 本课题研究的意义与主要内容 5

1.4.1 本课题研究的意义 5

1.4.2 本课题研究的主要内容 5

第二章 材料与方法 7

2.1 实验材料与设备 7

2.1.1 主要材料与试剂 7

2.1.2 实验设备 8

2.2 实验方法 8

2.2.1 易错PCR 8

2.2.2 连接转化 9

2.2.3 提质粒 10

2.2.4 纯化方法 10

2.2.5 胶回收 11

2.3 培养方法 11

2.3.1 平板培养 11

2.3.2 种子液培养 11

2.3.3 摇瓶发酵培养 11

2.4 分析方法 11

第三章 结果与讨论 13

3.1 木糖酸脱水酶突变库的构建 13

3.1.1 重组质粒pCWJ-YjhG的构建 13

3.1.2 含YjhG基因突变库的构建..............................................................................14

3.2 初筛及复筛结果 14

3.3 突变位点分析 15

3.4 突变酶发酵时木糖酸消耗量的对比 16

第四章 结论与展望 18

4.1 结论 18

4.2 展望 18

参考文献 19

致谢 21

文献综述

木糖酸脱水酶

木糖酸脱水酶介绍

D-木糖酸脱水酶，系统命名是 D-木糖酸氢-裂解酶。木糖酸脱水酶有不同的菌株来源，比如嗜盐的古细菌富盐菌（Haloferax volcanii）、新月丙杆菌（Caulobacter crescentus）和假单胞菌（Pseudomonas sp.）^[1,2]，不同的菌种来源导致脱水酶的性质可能有较大的差别。不同来源的 D-木糖酸脱水酶可以利用不同的底物，比如 D-葡萄糖酸、D-木糖酸和 D-木糖^[1,3]。木糖酸脱水酶对微生物发酵生产化学产品的产量和质量等指标有重要影响，所以了解它的相关的性质可以加快生物转化的效率。虽然有了一些关于木糖酸脱水酶部分性质的文献报道，但是这些研究中多是关于木糖酸脱水酶的脱水活性的测定，目前并没有对其进行改造。

木糖酸脱水酶的应用

脱水酶可以催化脱水反应，使化合物脱去水并产生双键。木糖酸脱水酶是 BT 生物合成途径中的关键酶，此外，它还参与许多重要的代谢途径，如乙醇生物合成途径、木糖降解途径及戊糖/葡萄糖醛酸转化途径。D-木糖酸脱水酶是许多代谢途径中的重要酶，比如D-木糖酸脱水酶是乙二醇的生物合成途径中的关键酶^[3]。此外，木糖酸脱水酶还是戊糖和葡萄糖醛酸相互转化途径中的重要酶 ^[4]。木糖降解 III 途径也需要运用到木糖酸脱水酶。在乙二醇^[3]等有价值的化学品的生物合成中，以大肠杆菌YjhG为基础对D-木糖酸的脱水反应进行催化，得到2-酮-3-脱氧-D-木糖酸（KDX）。但是，YjhG的生化特性仍是未知的。为了提高生物转化的效率，我们运用易错PCR的方法对木糖酸脱水酶进行改造以改善其反应速率。

木糖酸

木糖酸简介

木糖酸，英文全称为xylonic acid。分子式为C₅H₁₀O_6，分子量大小为166.13，热稳定性好，pH值在2.5～8范围内加热至100℃不分解。木糖酸分子结构见图1-1。

请支付后下载全文，论文总字数：16884字