论文总字数：18250字

摘 要

随着医学水平的进步以及检测技术的不断改善，目前已发现多种疾病与氧化应激有关，因此研究各种抗氧化剂也变得越来越重要。核黄素作为一种生物必须物质，其抗氧化作用存在争议。为了进一步研究核黄素对细胞的生长情况以及抗氧化能力的影响，本文以BY4741为原始菌株，采用同源重组技术将编码核黄素合成酶RIB5基因敲除，构建出rib5△基因敲除菌。该菌在外源不添加核黄素时基本无法生长，当核黄素达到20 mg/L，菌体生长明显改善；在含有40 mg/L核黄素时，菌体生长基本恢复，此后核黄素浓度的升高对rib5△菌生长基本无影响，且高浓度核黄素无细胞毒性。同时随着核黄素弄的升高，rib5△菌消耗核黄素速率增加。通过平板点样实验可知，在4 mmol/L H₂O₂诱导的氧化胁迫下，核黄素浓度的升高可明显改善rib5△菌的生长情况，增强细胞的抗氧化能力。

关键词：基因敲除 核黄素 抗氧化能力 RIB5

ABSTRACT

With the improvement of medical level and detection technology, recently, more and more studies have found that oxidative stress may cause varieties of diseases, so it is necessary to study various antioxidants. It is shown that riboflavin has antioxidant property and can be used as antioxidant vitamin. To study the effect of riboflavin on cell growth and antioxidant capacity, herein, using BY4741 as the starting strain, and the recombinant strain RIB5 was constructed by knockout. Then the recombinant strain loses its capacity of introducing riboflavin. Then rib5△ was cultured in medium with different concentrations of exogenous riboflavin, and its OD600 value was measured every two hours to draw a growth curve. And according the growth curve, it can be found that in the medium with riboflavin concentration of 0, 20, 40, 60, 80 and 100 mg/L respectively, rib5△ could not grow without exogenous riboflavin. When the riboflavin reached 20 mg/L, the bacteria could grow. When the riboflavin contained 40 mg/L, the bacterial growth basically recovered. After that, as the concentration of riboflavin increased, the growth of rib5△ was not affected. Therefore, the culture medium containing 40 mg/L exogenous riboflavin is the most economical and effective for cell growth, and excessive riboflavin has no toxic and side effects on cell growth. Then the rib5△ under the above conditions were tested for antioxidant, cultured under oxidative stress respectively, and its growth was detected. The results showed that the growth of rib5△ is basically the same as that of growth curve when no oxidative stress is available，while the growth of rib5△ was significantly improved with the increase of riboflavin concentration under oxidative stress, indicating that the antioxidant capacity of rib5△ could be significantly enhanced by exogenous riboflavin addition.

Key words : gene knockout; riboflavin; the antioxidant capacity; RIB5

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2 氧化应激 1

1.3 核黄素 2

1.3.1 核黄素特性的简单介绍 2

1.3.2 核黄素相关特性的研究进展 4

1.4 本文的研究内容与目的 4

1.4.1 研究目的 4

1.4.2 研究内容 4

第二章 实验内容 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 菌种与质粒 6

2.1.2 主要工具酶和试剂盒表 6

2.1.3 主要试剂 7

2.1.4 主要仪器 8

2.1.5 培养基 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 大肠杆菌化学感受态制备及转化方法 9

2.2.2 酿酒酵母化学感受态的制备与转化 10

2.2.3 rib5△敲除菌的构建及验证 10

2.2.4 RIB5回补菌的性状验证 13

2.2.5 培养基内核黄素的检测 15

2.2.6 外源不同浓度核黄素对rib5△生长及抗氧化表型的测定 15

第三章 结果与讨论 17

3.1 结果与讨论 17

3.1.1 RIB5基因敲除盒的验证 17

3.1.2 rib5△敲除菌的验证 17

3.1.3 RIB5回补菌构建及验证 18

3.1.4 RIB5回补菌的性状验证 19

3.1.5 不同浓度核黄素下rib5△生长性状 20

3.1.6 培养基内核黄素浓度的变化 21

3.1.7 rib5△在不同浓度核黄素下抗氧化能力变化 22

第四章 结论与展望 24

4.1 结论 24

4.2 展望 24

参考文献 25

致谢 27

文献综述

1.1前言

1956年，Harman提出自由基会造成机体衰老这一理论^[1]，随后自由基便受到科学界内的广泛关注。在细胞内，自由基是以氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）形式存在，主要包括羟基自由基（•OH)、超氧阴离子(O₂^•- )、过氧化氢（H₂O₂）等^[2]。1990年时由Sohal等人首次提出氧化应激这一概念，即体内活性氧产生过多或者抗氧化能力降低，导致胞内活性氧堆积，诱导氧化应激发生^[3]。需氧真核生物在正常的生理代谢过程中不可避免地会产生ROS，而如果这些ROS得不到及时的清除，在体内大量累积就会容易造成体内氧化还原平衡失调，导致多种生物大分子发生氧化损伤，诱导细胞凋亡^[4]。随着医疗水平的提高以及检测技术的不断改善，目前已发现多种疾病与氧化应激有关。因此，研究细胞氧化应激响应机制及抗氧化剂具有重要的医学意义。

在本实验中以酿酒酵母作为主要研究对象，主要原因如下：首先酿酒酵母作为一种常见的真核生物模式菌，因其具有其易培养、可形成单/双倍体、可使大量细胞处于同一状态等特点而被广泛用于实验研究；同时酿酒酵母基因组的测序早在1996年便已完成，因此目前基于酿酒酵母的分析平台以及分子操作技术都已经十分成熟，制备各种基因突变体也更为容易，用酿酒酵母细胞进行研究也变得方便可行；此外由于酿酒酵母细胞在抗氧化机制方面和哺乳动物的颇为相似，且有超过25％的人类退行性疾病相关基因在酵母中具有同源基因^[5]。因此在氧化应激等研究方向中使用酿酒酵母代替人源细胞也已成为目前医学研究的一大热门方向。

1.2 氧化应激

有研究表明氧化应激与衰老有着密不可分的关系。Harman提出的自由基假说认为衰老是由于正常细胞代谢会产生大量自由基，这些自由基可造成细胞内多种生物大分子如DNA 、蛋白质及脂质^[6]。在细胞老化的过程中，由于细胞功能逐渐下降，抗氧化剂减少，氧化损伤增加，从而导致多种疾病发生的几率大大上升。目前多个研究已经证明氧化应激参与多种疾病的产生及发展过程，如糖尿病、肝功能损伤、慢性肾功能衰竭等。同时氧化应激与阿尔茨海默病也有关系，在阿尔兹海默症发展过程中，大脑中的氧化剂被释放，导致过度氧化应激^[7]。由于多种重要疾病的发生及发展都与氧化应激有着密切的联系，因此目前研究氧化应激已成为一种热门趋势。

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