论文总字数：24572字

摘 要

本文研究了两种生物膜载体（聚丙烯腈和氨基改性聚丙烯腈）对玉米秸秆厌氧发酵产甲烷的影响。实验结果表明，氨基改性聚丙烯腈有最大的沼气产量和甲烷产量，分别比对照组提高了42.69％和37.29％。在厌氧消化过程中，分析了pH值、化学需氧量（COD）、总固体含量（TS）、挥发性固体含量（VS）、挥发性脂肪酸浓度（VFA）、辅酶F₄₂₀浓度和微生物群落结构。氨基改性聚丙烯腈体系具有最高的有机物去除效率，并且比其他体系更好地调节系统的pH值。高通量测序分析的结果表明，生物膜载体的介入可调节厌氧发酵系统的微生物群落结构组成，调控了水解/酸化阶段细菌的相对丰度，提高了有机酸的周转速率，进而提高沼气和CH₄的产量。甲烷八叠球菌随着发酵的进行逐渐取代其他产甲烷菌，成为优势甲烷菌。

关键词: 氨基修饰生物膜载体; 厌氧消化; 玉米秸秆; 沼气; 微生物群落

Effect of amino-modified polyacrylonitrile on anaerobic fermentation of corn stover for methane production

Abstract

This paper studied the property of two different biofilm carriers added into the anaerobic digestion systems, a polyacrylonitrile, and a polyacrylonitrile modified with diethylenetriamine (PAN-NH₂). The PAN-NH₂ system kept the maximum biogas and methane production, which were 42.69% and 37.29% higher than the control system, respectively. The value of pH and chemical oxygen demand, the content of total solid and volatile solid, volatile fatty acids concentration, coenzyme F₄₂₀ concentration, and microbial community analysis were investigated during the anaerobic digestion process. The PAN-NH₂ system had the highest removal efficiency of the pollutants, and regulated the pH of the system better than other systems. The result of high-throughput sequencing analysis showed that the addition of biofilm carriers and mediation with amino-groups adjusted system pH and improved biogas and CH₄ production by reducing the relative abundance of bacteria in the hydrolysis/acidogenesis stages. Methanosarcina gradually replaced other methanogens during the experimental runs and was the dominant methanogen at the end of the anaerobic digestion process.

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Key words:Amino modified biofilm carrier; Anaerobic digestion; Corn straw; Biogas; Microbial community

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 玉米秸秆发酵现状 1

1.2.1 玉米秸秆（CS）厌氧发酵的原理^[14-16] 1

1.2.2 秸秆发酵存在的问题 3

1.3 生物膜载体对厌氧发酵的影响 3

1.4 本课题研究内容，目的及意义 4

1.4.1 本课题研究目的及意义 4

1.4.2 本课题的主要研究内容 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验材料及仪器、设备 5

2.1.1 实验材料 5

2.1.2 主要仪器及设备 5

2.2 实验方法 6

2.2.1 接种物的驯化 6

2.2.2 氨基改性聚丙烯腈（PAN-NH₂）的合成 6

2.2.3 生物膜载体的处理 7

2.2.4 厌氧发酵过程的设计和操作 7

2.2.5 沼气的分析 7

2.2.6 实验过程中pH值的测定 8

2.2.7 测量材料的接触角和红外光谱的测试 8

2.2.8 COD的变化分析 8

2.2.9 紫外分光光度法测定辅酶F₄₂₀ 8

2.2.10 气相色谱对VFAs的测定 9

2.2.11 微生物群落特征及代谢途径分析 9

第三章 结果与讨论 10

3.1 厌氧发酵过程中的pH变化 10

3.2 氨基改性聚丙烯腈的表征 10

3.3 厌氧发酵过程中沼气和CH₄产量的变化 12

3.4 TS、VS和COD的变化 13

3.5 厌氧发酵过程中有机酸浓度的变化 14

3.6 厌氧发酵过程中辅酶F₄₂₀浓度的变化 15

3.7 微生物群落组成 16

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

第一章 文献综述

1.1 前言

在过去的二十年中，环境污染日益严重和农业废弃物处理成本高昂的问题已成为一个令人关注的问题^[1]。我国每年生产农作物秸秆8.4亿吨以上，其中以玉米秸秆(CS)、小麦秸秆和稻秆为主^[2]。农作物秸秆处理不当会浪费有机资源，造成环境污染^[3-6]。厌氧发酵(AD)是一种可控的厌氧生物降解过程，它将有机底物转化为沼气，通过不同厌氧微生物之间的协同作用，将甲烷(CH₄)、二氧化碳(CO₂)等多种气体结合在一起^[7]。然而，玉米秸秆的厌氧发酵过程中的限速步骤是水解，其受包含纤维素，半纤维素和木质素的秸秆特异性木质纤维素结构的影响^[8,9]。近年来的文献表明，厌氧发酵反应器存在水力停留时间短、对冲击负荷敏感、传质效率低、启动速度慢等缺点^[10]。因此，迫切需要一种新方法来促进微生物和底物之间的传质效率。例如，将生物膜载体添加到厌氧发酵系统中是一种可行的方法^[11]。

1.2 玉米秸秆发酵现状

我国作为农业大国，同时也是秸秆产量大国，仅是玉米秸秆就多达2.8亿吨，而其中只利用了60%^[12]。大量未利用秸秆未得到合理的处置，不仅浪费资源，甚至危害环境，加剧全球温室效应。沼气作为一种变废为宝的清洁可再生能源，可以有效且环保的解决此类问题。同时，发酵过程剩余的沼液和沼渣可以作为优质有机肥使用^[13]。目前，全球的化石能源日益紧张，煤矿、石油和天然气资源耗尽近在眼前。农业沼气发展是我国新能源发展的一大课题，大力研究和实际运用势在必行。

1.2.1 玉米秸秆（CS）厌氧发酵的原理^[14-16]

厌氧发酵是指，微生物在厌氧环境下，对底物进行一系列分解转化产生甲烷和二氧化碳的过程^[17]。厌氧发酵产甲烷过程见图1-1。

产氢产乙酸菌

同型乙酸菌

产甲烷菌

发酵细菌

图1-1 厌氧发酵产甲烷过程

厌氧发酵产甲烷过程主要分为三个阶段：水解、产酸、产甲烷阶段。水解阶段主要是指厌氧微生物将碳水化合物等大分子有机质水解为氨基酸、有机酸等小分子有机物，并产生NH₃和H₂S等物质。主要的反应过程如下：

(C₆H₁₀O₅)_n nH₂O→nC₆H₁₂O₆

(R-CHNH₂COOH)_n nH₂O→nR-CHOH₂COOH nNH₃ C₃H₅(OCOR)₃ 3H₂O→C₃H₅(OH)₃ 3RCOOH

产酸阶段是指微生物利用水解阶段产生的小分子有机物产生乙酸、丙酸、丁酸等挥发性有机酸以及H₂和CO₂，再由产氢产乙酸菌将丙酸、丁酸和醇类等转化为乙酸、氢和二氧化碳等。同时同类型的乙酸菌将H₂和CO₂转化为乙酸。主要的反应过程如下：

CH₃CHOHCOO^- 2H₂O→CH₃COO^- HCO₃^- H 2H₂ CH₃CH₂OH H₂O→CH₃COO^- H 2H₂ CH₃(CH₂)₂COO^- 2H₂O→2CH₃COO^- H 2H₂ CH₃CH₂COO^- 3H₂O→CH₃COO^- HCO₃^- H 3H₂

4CH₃OH 2CO₂→3CH₃COOH 2H₂O

2HCO₃^- 4H₂ H →CH₃COO^- 4H₂O

产甲烷阶段是将挥发性脂肪酸、H₂和CO₂在产甲烷微生物的作用下代谢生产甲烷。主要的反应过程如下：

CH₃COOH→CH₄ CO₂ CO₂ 4H₂→CH₄ 2H₂O HCOOH 3H₂→CH₄ 2H₂O CH₃OH H₂→CH₄ H₂O 4CH₃NH₂ 2H₂O 4H →3CH₄ CO₂ 4NH₄

玉米秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，属于木质纤维素原料，此外还包含少量的胶质、蛋白质、及矿物质等^[18]。

1.2.2 秸秆发酵存在的问题

发酵细菌，产乙酸细菌和产甲烷菌是厌氧发酵系统中三种典型的微生物类型。产甲烷菌是三种微生物中最重要的细菌，因为它们可以在厌氧发酵过程中将有机底物转化为CH₄ ^[19]。产乙酸细菌和产甲烷菌之间缓慢的相互作用限制了产甲烷效率^[20]。在厌氧发酵过程的早期阶段，发酵和产乙酸细菌会将玉米秸秆水解成乙酸并降低pH值以降低产甲烷菌的活性^[21]。

1.3 生物膜载体对厌氧发酵的影响

理想的生物膜载体具有几个特性，例如耐酸，耐碱和生物降解，稳定性，大比表面积，重量轻和高强度，以及生物相容性。此外，载体不仅应该不受细胞的伤害，而且对于实际应用来说也是便宜的。已经在厌氧发酵系统中研究了许多生物膜载体以富集细菌^[22,23]。聚丙烯腈（PAN）因其价格低廉，来源广泛，各种稳定和优异的性能而广泛用作制备离子交换纤维的基础材料^[24,25]，氰基易于改性^26]在PAN上。然而，PAN不是良好的亲水性材料。以前的工作表明纤维材料可以提高厌氧发酵效率^[27]。先前在实验室中的研究表明选择PAN用于胺化修饰。此外，PAN易于修改和工业应用。用二亚乙基三胺（PAN-NH₂）改性的PAN不仅增强了亲水性^[28]，而且由于氨基的引入对酸性环境具有一定的调节能力。

1.4 本课题研究内容，目的及意义

1.4.1 本课题研究目的及意义

本课题构建基于功能材料介导的厌氧产甲烷多细胞高效发酵系统，利用高通量测序技术考察微生物群落的变化动态及与产气效率的关系。

1.4.2 本课题的主要研究内容

本课题拟通过加入聚丙烯腈来解决玉米秸秆厌氧发酵产气效率低、原料利用率低等问题，并对聚丙烯腈进行氨基改性，以克服发酵初期出现的发酵体系酸化的现象，提高厌氧发酵产气量，进而提高玉米秸秆的利用效率。

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料及仪器、设备

2.1.1 实验材料

原料：玉米秸秆（CS），自然风干后粉碎过40目筛；聚丙烯腈（PAN）；沼液，取自南京工业大学沼气站的沼液。

表2-1 实验所用试剂表

2.1.2 主要仪器及设备

表2-2实验所用仪器表

2.2 实验方法

2.2.1 接种物的驯化

接种物取自南京工业大学300 m³生物厌氧发酵罐。该发酵罐每6小时间隔搅拌一小时，以确保固体和液体均匀分散，水力停留时间30天，发酵温度为39±1℃。将接种物在实验室中进行驯化，直至每日CH₄浓度达到约60％并且每日沼气产量超过1000 mL。驯化后，可用于后续实验。接种物的TS和VS分别为4.98±0.02％和3.02±0.04％。

2.2.2 氨基改性聚丙烯腈（PAN-NH₂）的合成

PAN-NH₂的合成包括两个步骤：

第一步，100 g聚丙烯腈（PAN），375 mL水，7125 mL乙醇，300 g NaOH，85℃加热6小时，抽滤，乙醇定型后，得-COOH改性纤维。重103.03 g。

第二步:100 g -COOH改性纤维，1320 mL水，3680 mL乙醇，500 mL二乙烯三胺，120℃加热4小时，抽滤，乙醇定型后得到-NH₂改性纤维。重141.9 g。

氨基改性过程见图2-1。

图2-1 氨基改性过程

2.2.3 生物膜载体的处理

所有载体必须用纯水冲洗三次，确保除去任何附着的杂质，然后再加入厌氧发酵系统^[29]。将PAN和PAN-NH₂切成5 mm正方形，厚约1 mm ^[27]。每个厌氧发酵系统具有约200块生物膜载体，它们占据约5.5 cm ³的空间，与工作体积相比可忽略不计。

2.2.4 厌氧发酵过程的设计和操作

本实验针对不同系统设计了厌氧发酵工艺，初始TS含量为8％，初始pH值约为7.0。每个系统由三个瓶子组成，其中包括一个工作容积为800 mL的1000 mL发酵瓶，一个1000 mL的气体收集瓶和一个1000 mL的水收集瓶。将5 g生物膜载体加入发酵瓶中，并设置不添加生物膜载体的对照组。

通过计算，在每个发酵瓶中混合57.61 g 玉米秸秆，240 mL接种物和502.39 mL纯水，并用尿素将碳氮比（C：N）调节至25：1。将生物膜载体，接种物和玉米秸秆通过振荡发酵瓶均匀分散，注入氮气5分钟。将所有瓶子放入生物培养箱中，厌氧发酵过程在38±1℃下操作。对每个载体系统和控制系统进行三组平行实验。每24小时采集并分析生物气样品。在第0，9，16，23，30和41天对来自每个系统的发酵液进行取样并及时分析。测试气体样品的CH₄浓度，并测试发酵液样品的化学需氧量（COD）、TS含量、VS含量、挥发性脂肪酸（VFA）浓度、pH和辅酶F₄₂₀的浓度。厌氧发酵装置见图2-2。

图2-2 厌氧发酵实验装置图

2.2.5 沼气的分析

采用排水集气法测定每日沼气产量，并通过气相色谱（GC）测试每日CH₄浓度。为了分析甲烷浓度，在厌氧条件下使用注射器收集1 mL生物气样品。将样品注入配备有HP-PLOTU毛细管柱和HayeSep Q多孔聚合物色谱柱的GC（SP6800A，Rainbow Chemical Instrument Co.，Ltd.，Shandong Lunan，China）。烘箱、检测器和导热检测器温度分别为为60℃、120℃和120℃。载气流量（He）为53 mL/min。

2.2.6 实验过程中pH值的测定

使用pH计（UB，China测定）pH值。

2.2.7 测量材料的接触角和红外光谱的测试

改性前后聚丙烯腈接触角的结果由接触角测量仪（Kruss DSA-100）进行测定，红外光谱分析则用380傅里叶变换红外光谱仪进行测试。

2.2.8 COD的变化分析

将所取样品，7500 rpm离心15 min，取上清液1 mL于10 mL的试管中，加9 mL的水稀释10倍；取稀释10倍的上清液1 mL再稀释十倍，将稀释100倍的上清液用移液枪取2.5 mL，备测。

2.2.9 紫外分光光度法测定辅酶F₄₂₀

取20mg样品，用40mL生理盐水稀释，在4500r/min下离心15min,弃去上清液，重复两次该操作。将离心后的底泥用30mL生理盐水稀释，并在95℃下加热20min。加热过程中适当搅拌使其均匀受热，记录冷却后的体积。用2.5倍水样体积的乙醇稀释混匀，在4500r/min条件下离心15min,收集呈亮黄色的上清液。加入4mol/L的NaOH溶液将pH调为13.5,记录体积。然后在10000r/min下离心10min,取上清液。上清液分为两份，一份加入6mol/L的HCl溶液将pH调到3以下，记录加HCl前后体积。另一份加入与酸等量的纯水，用pH值低于3的样作为参比样，加纯水的那一份作为试样，采用紫外分光光度计测定，调检测波长为420 nm。

2.2.10 气相色谱对VFAs的测定

采用仪器型号为安捷伦GC7890B，FID检测器，分析柱为HP-Innowax色谱柱(60 m*0.320 mm)，载气(He)流速为40cm/s；柱温，进样口和检测器温度分别为100 ℃、250 ℃和300 ℃，进行有机酸测定前需将样品与甲酸100：3酸化处理，过0.22 μm有机滤膜备用。

2.2.11 微生物群落特征及代谢途径分析

通过高通量16S rRNA基因焦磷酸测序分析微生物群落组成^[30]。使用用于土壤的Ezup基因组DNA提取试剂盒（PowerSoil DNA Isolation Kit Components; Mo-Bio，Carlsbad，CA，USA）提取DNA。从每个发酵瓶的底部收集10 mL发酵污泥，并在4℃以11,000 rpm离心20分钟。初步培养的污泥样品经发酵摇匀后采集，并进行了相似的处理。使用通用引物515F（5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3'）/ 909R（5'-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3'）放大古细菌和细菌16S rRNA基因的V3-V4区域。详细的聚合酶链反应（PCR）条件与先前研究中报道的相同^[31]。如Illumina文库制备方案中所述，将纯化的文库稀释，变性，再稀释，与PhiX（相当于最终DNA量的30％）混合，然后应用于Illumina Miseq系统，用Reagent Kit v2 2×250 bp中国科学院成都生物研究所（四川，中国）^[27]进行测序。采用高质量序列长度为gt; 300 bp，平均碱基质量分数为gt; 30，无模糊碱基‘N’）进行下游分析。将高质量序列以97%的识别阈值聚成操作分类单元（OTUs）。所有样本随机重采样到13760个reads^[32]。

第三章 结果与讨论

3.1 厌氧发酵过程中的pH变化

每个厌氧发酵系统的pH值见图3-1。在第9天，PAN-NH₂体系，PAN体系和对照组系统中的pH值分别从7.13降至7.03,6.80和6.70。PAN-NH₂体系中的pH值比其他两个系统中记录的pH值相对更稳定。

这种现象可能归因于氨基参与低pH系统中的质子化反应。发酵系统中的氢离子转移到载体材料并减少PAN-NH₂体系中的H 量。中性pH范围有利于厌氧发酵过程，因为大多数产甲烷菌在6.7-7.4的pH范围内起作用，最佳pH值为7.0-7.2^[33]。若体系的pH低于6.5或者高于7.5，产甲烷菌的活性和CH₄产率将受到强烈抑制^[34,35]。

图3-1 厌氧发酵过程中的pH变化

3.2 氨基改性聚丙烯腈的表征

水和亲水材料之间的接触角是锐角，而水和疏水材料之间的接触角是正角或钝角^[36]。图3-2显示了PAN-NH₂和PAN的接触角结果，表明PAN-NH₂的亲水性优于PAN。

图3-2 氨基改性前后材料的接触角变化

PAN-NH₂和PAN的红外表征见图3-3。

图3-3 氨基改性前后材料的红外表征结果

PAN具有尖峰，在PAN-NH₂体系中在2228-2248 cm^-1处没有吸光度，这是氰基的C-N伸缩振动峰^[44]。因此，其他组在修饰期间替换了PAN的氰基。 PAN-NH₂在1570-1610和650-900 cm^-1处具有宽峰，其分别是氨基的N-H伸缩和弯曲振动峰^[45]。PAN-NH₂显示具有氨基，并且修饰成功。PAN-NH₂在1650-1770 cm^-1和1420和900-950 cm^-1处也具有弱的吸收峰，这分别是羧基的C = O伸缩和O-H弯曲振动峰^[46,47]。因此，在第一步中加入羧基，在第二步中用氨基取代。

3.3 厌氧发酵过程中沼气和CH₄产量的变化

图3-4（a）显示生物膜载体系统比对照组系统更早地达到单日最高的沼气产量，并且在厌氧发酵期间保持高的沼气生产效率。

PAN-NH₂体系最早达到产气峰值（超过1000 mL / d）。每日CH₄浓度在第3天开始明显增加并且在第10-14天时达到峰值。每日CH₄含量的峰值约为60％（图3-4（b））。

CH₄的生产趋势与沼气生产相似（图3-4（c））。在稳定条件下CH₄与沼气的比例（图3-4（b））表明，不同生物膜载体表面的甲烷八叠球菌在实验期间维持稳定和平滑，在CH₄产生中起关键作用。

此外，与生物膜载体系统相比，对照组系统具有较低的沼气和甲烷生产效率。PAN-NH₂体系具有最大的生物气和CH₄生产效率，其次是PAN体系（图3-4（d）和表3-1）。PAN-NH₂体系和 PAN体系中的沼气产量分别为383.23±32.11 m³ / t, 332.90±41.11 m³ / t干物质，分别比对照组提高了42.69％和23.95％。PAN-NH₂体系和PAN体系的CH₄产量分别为175.42±18.99 m³ / t和158.52±17.32 m³ / t干物质，分别比对照组提高了37.29％和24.07％。

这些结果表明，在相同的厌氧工作条件下，与对照组系统相比，生物膜载体系统中的沼气和CH₄产量增加。PAN-NH₂体系保持稳定的pH，这提高了生物膜载体维持厌氧发酵系统中优势微生物的能力。因此，选择合适的生物膜载体在玉米秸秆的厌氧发酵过程中起关键作用。基于上述结果，PAN-NH₂在两种检测的厌氧发酵生物膜载体中是最有效的。 PAN-NH₂便宜易得，并且可以容易地成形生物膜。

图3-4 发酵过程中各发酵体系沼气日产气量变化（a），日产甲烷含量变化（b），甲烷日产气量变化（c），沼气总产气量和甲烷总产气量变化（d）

表3-1对照组与生物膜载体的厌氧发酵工艺过程中总沼气产量、甲烷产量的比较

3.4 TS、VS和COD的变化

沼气和CH₄产量与有机底物代谢速率有关（从COD、TS和VS来看）^[37,38]。初始COD值为17650±242 mg/L。初始TS和VS分别为8.00±0.25%和6.45±0.14%。由表3-1可知，PAN-NH₂体系在玉米秸秆厌氧发酵过程中产气量优于PAN体系和对照组系统，且所有生物膜载体系统的效果均优于对照组系统。研究了TS，VS和COD的去除效率以进一步鉴定PAN-NH₂的强度（表3-2）。厌氧发酵工艺结束时，PAN-NH₂体系TS、VS、COD的去除率分别达到33.37%、65.38%、87.92%，分别比对照组系统的去除率高53.71%、33.35%、39.98%。

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