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摘 要

粘康酸(Muconic Acid，MA)，又被称作己二烯二酸，是一种不饱和二元羧酸，具有十分广阔的应用前景。在某些有机合成的工业中，粘康酸可以作为树脂、医药、食品和农药的基础原料，广泛应用于抗紫外线防护以及军工特种用品，主要应用于合成大批的化学品己二酸以及对苯二甲酸。传统的MA生产主要以芳香族化合物为原料，虽然所产MA的浓度、产量和产率都比较高，但是芳香族化合物以石油为主要来源，污染环境且生产成本高。而生物法合成MA符合可持续发展和绿色合成的理念，越来越受到研究人员的关注，引发了广泛的研究和探索，并取得了诸多成果。本文拟构建可以在大肠杆菌中表达邻苯二酚1,2-双加氧酶的一种重组菌，而且利用重组之后的全细胞来催化儿茶酚合成粘康酸，以及增加由补料分批策略MA的浓度。

关键词：全细胞催化 粘康酸 邻苯二酚1，2-双加氧酶 大肠杆菌

Whole cell catalytic synthesis of gluconic acid from catechol

Abstract

Mucoconic acid (Muconic Acid,MA), also known as adipic acid, It is a kind of unsaturated dicarboxylic acid with wide application prospect. It is mainly used in the synthesis of major chemicals adipic acid and terephthalic acid .Traditional MA production is mainly based on aromatic compounds As raw material , although the concentration, yield and yield of MA are relatively high , aromatic compounds are mainly derived from petroleum, pollute the environment and have high production cost . Biological synthesis of MA accords with the concept of sustainable development and green synthesis, and has been paid more and more attention by researchers, which has aroused extensive research and exploration, and has achieved many achievements . In this paper, a recombinant strain expressing catechol 1,2-dioxygenase in E. coli was constructed and used to catalyze the synthesis of gluconic acid from catechol in whole cell. The concentration of MA was increased by batch feeding strategy.

Key Words: Whole cell catalysis; Mucoacid; Catechol 1,2-dioxygenase; E. coli

目录

第一章 文献综述 1

1.1 粘康酸简介 1

1.2 双加氧酶作用机制 2

1.3 全细胞催化 3

1.4 本论文的研究内容 3

第二章 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 载体与菌株 5

2.1.2 主要试剂 5

2.1.3 主要仪器与设备 5

2.1.4 培养基与培养条件 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 7

2.2.2 大肠杆菌转化子的筛选与验证 8

2.2.3 重组菌株的构建与酶的诱导表达 8

2.2.4 SDS-PAGE检测 9

2.2.5 分析方法 9

第三章 结果与讨论 11

3.1 重组菌构建 11

3.1.1 转化子筛选 11

3.1.2 酶的诱导表达与SDS-PAGE分析 11

3.2 邻苯二酚1,2双加氧酶的表达条件优化 12

3.2.1 IPTG浓度对邻苯二酚1,2双加氧酶表达的影响 12

3.2.2 诱导时间对邻苯二酚1,2双加氧酶表达的影响 13

3.3 全细胞催化邻苯二酚产粘康酸的条件优化 14

3.3.1 温度对全细胞催化邻苯二酚产粘康酸的影响 14

3.3.2 pH对全细胞催化邻苯二酚产粘康酸的影响 14

3.4 利用分批补料策略全细胞催化邻苯二酚合成粘康酸 15

第四章 结论与展望 17

4.1结论 17

4.2展望 17

参考文献 18

致谢 20

第一章 文献综述

1.1 粘康酸简介

粘康酸(Muconic Acid，MA)是一种具有广阔应用前景的 C6 平台化合物，作为一种高附加值的具有活性的二羧基和共轭双键的生物产品，cc MA由于其在商业重要大宗化学品生产中的潜在应用而受到越来越多的关注，如己二酸、对苯二甲酸、偏苯甲酸、新型功能树脂等。

其中，己二酸是一种六碳二羧酸，它几乎与90％的尼龙生产有关，并可进一步加工成纤维，用于生产地毯、汽车轮胎线和服装^[1]。大多数商业己二酸是由环己烷通过两步氧化处理所生产出来的。这种劣质工艺的产量很低，所用的化学品对环境有害^[2]。另外，己二酸可以利用顺式，顺式—粘康酸(cc MA)通过化学加氢制备。通过发酵从可再生资源中生产cc MA，再氢化生成己二酸，这一方法非常理想，因为这种己二酸的合成途径比传统的石化路线更加对环境友好^[3]。尽管许多微生物可以将一些芳香族化合物(例如儿茶酚，苯甲酸盐和甲苯)转化为cc MA，但基于这些生物转化几乎不可能开发出经济上可行和环境友好的方法。因此，最近的努力集中于基于从头生物合成途径设计的更有可能的cc MA生产方法(图1-1)。此外，cc MA具有反应性羧酸盐基团和共轭双键构型，可用作原料新功能树脂、药物和农用化学品^[4]。

cc MA不是由任何已知生物从可再生糖中内源产生的，但它可以通过芳香族化合物(如苯酚、甲苯、苯甲醇和苯甲酸)的分解代谢产生，包括许多生物，例如酵母(如念珠菌属)以及细菌(如不动杆菌属、假单胞菌属、红球菌属、鞘氨醇属)^[5-7]。然而，cc MA也可以通过采用异源合成途径从可再生葡萄糖中产生，也就是从莽草酸途径中的天然存在的中间体中提取(图1-1)^[8-11]。在所有这些cc MA合成途径以及芳香族化合物的分解代谢途径中，儿茶酚1,2-双加氧酶(Cat A)是转化儿茶酚以产生cc MA的最后和最重要的酶(图1-1)。尽管许多微生物可以将一些芳香族化合物(例如儿茶酚，苯甲酸盐和甲苯)转化为cc MA，但基于这些生物转化几乎不可能开发出经济上可行和环境友好的方法。因此，最近的努力集中于基于从头生物合成途径设计的更有可能的cc MA生产方法(图1-1)。

图1-1 从葡萄糖生产顺式，顺式-粘康酸的合成途径的总结

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