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摘 要

通过富集培养和涂布纯化，从受苯胺污染的土壤中筛选出了三株苯胺降解菌，分别命名为M1、M2、M3。通过16S rDNA 基因序列分析，初步鉴定菌株。结果表明，菌株 M1 为寡养单胞菌(stenotropHomonas sp.)，菌株 M2 为β-变形杆菌(betaproteobacteria bacterium)，菌株 M3 为假单胞菌(Pseudomonas)。采用萘乙胺偶氮法测定苯胺浓度，结合单因素试验法确定三株苯胺降解菌的最优pH和最优接种量，并确定菌株在最优pH和最优接种量下降解苯胺的能力，其中M1菌株在pH为7、接种量10%的培养条件下降解苯胺的效率最高,达到了81%，M2菌株在pH为6、接种量10%的培养条件下降解苯胺的效率最高，达到了73.5%，M3菌株在pH为7、接种量15%的培养条件下降解苯胺的效率最高，达到了74.5%。因此，获得了降解苯胺最高效的菌株M1,其培养的最优pH为7，最优接种量为10%。

关键词：苯胺降解菌 生物降解 分离筛选 假单胞菌

Screening and Identification of Aniline Degrading Bacteria

ABSTRACT

Three strains of aniline degrading bacteria were selected from soil contaminated with aniline by enrichment culture, coating and purification, and named as M1, M2 and M3, respectively. The strains were initially identified by 16S rDNA gene sequence analysis. The results showed that the strain M1 was stenotropHomonas sp., the strain M2 was betaproteobacteria bacterium, and the strain M3 was Pseudomonas. The concentration of aniline was determined by the method of napHthalene ethylamine azo and the optimum pH and inoculum size of three strains of aniline degrading bacteria were determined in combination with the single factor test method. The ability of the strain to degrade aniline at the optimal pH and optimum inoculum size was determined. Among them, M1 strain had the highest efficiency of degradation of aniline at pH 7 and inoculation of 10%, reaching 81%. M2 strain had the highest efficiency of degradation of aniline under the conditions of pH 6 and inoculation of 10%. 73.5% of strain M3 had the highest efficiency of degradation of aniline at pH 7 and inoculation of 15%, which reached 74.5%. Therefore, the most efficient strain of aniline degrading M1 was obtained, and its optimal pH for culture was 7, The optimal inoculation amount is 10%.

Key Words:Aniline degrading bacteria;Biodegradable;Separation screening;Pseudomonas

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1 前言 1

1.2 生物法降解苯胺 1

1.2.1 现状 1

1.2.2 苯胺降解菌 2

1.3 研究意义 2

第二章 实验材料与方法 4

2.1 实验材料与仪器 4

2.1.1 实验材料 4

2.1.2 实验仪器 5

2.2 实验方法 6

2.2.1 苯胺降解菌的筛选 6

2.2.2 表面形态观察 6

2.2.3 16S rDNA 序列测定 7

2.2.4 苯胺降解菌条件优化 7

2.2.5 苯胺降解能力测定 7

第三章 实验结果与讨论 9

3.1 菌株的筛选 9

3.2 菌株鉴定结果 9

3.2.1 革兰氏染色结果 9

3.2.2 16S rDNA基因鉴定 9

3.3 苯胺降解菌的降解能力 12

3.3.1 标准曲线 13

3.3.2 M1菌株降解苯胺 13

3.3.3 M2菌株降解苯胺 15

3.3.4 M3菌株降解苯胺 16

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

附录 22

致谢 24

第一章 绪论

1.1 前言

苯胺是一种分布广泛的环境污染物，污水及土壤里的苯胺根据调查，大多是来自于制药、印刷、纺织等的生产^[1]；同时也可能来自一些化合物的转化，例如一些芳香类物质的生物降解过程^[2]；另外，在染化废水和印染废水的脱色过程中也会产生较高浓度的苯胺^[3]，随着如今工业废水水量加大，对处理废水的需求也会增多，但是，需要引起警惕的是不当的处理可能加重污染。苯胺有毒，它的毒性主要是由于它会使血红蛋白结合氧的能力下降^[4]，并且它易于吸收，能穿过皮肤^[5]，如果吞入或吸入蒸气可能致命，所以苯胺是一种危险物质。苯胺受法律控制，受欧洲经济共同体（欧共体）指令和处于欧盟美国环保局优先污染清单中。据齐和奥尼尔等人发现美国和中国年产苯胺8万吨以上，45.7万吨/年苯胺。中国东北地区的原油包含与其他氮化合物相比，氮化合物更多的国家，因为它们的地质来源。结果，由此产生的废水这种原油的处理富含苯胺，这使得有效处理废水变得复杂化。 作为处理这种废水的工具，苯胺以及其大部分衍生品经常被使用光解，电解，树脂吸附或臭氧氧化，但这种处理的成本限制他们在小规模设施中的应用。由于它的毒性和顽固性以及苯胺类化合物的广泛应用，苯胺被认为是一种在线化学品，既对环境又对人类构成威胁健康。 因此，环境中苯胺的命运非常令人关注。这些年来，随着苯胺污染物的逐渐增多，人们也迫切地寻求着解决这一问题的方法，也尝试了许多方法，微生物处理凭借着它的有效性而被广泛关注，让微生物法成为了解决这一问题的主要方法^[6]。

1.2 生物法降解苯胺

1.2.1 现状

几种物理和化学方法，例如吸附，氧化通过臭氧化和电化学处理已被使用处理含苯胺的废水。与物理或化学法处理苯胺相比，用生物法降解苯胺的操作简单、价格便宜且处理效果好，因而如今大多采用生物法来处理污水和土壤中存在的苯胺^[7]。虽然微生物法有许多优点，但苯胺实际上来说其实并不是很容易进行生物降解^[8]。根据报道，有相当一部分苯胺降解菌已被发现^[9]。如盛多红分离出一株 Acinetobactersp．^[10];Boon 等分离到 2 株均鉴定为Delftia aci-dovorans的菌株LME 和 B8c^[11];Liu 等从活性污泥中分离到一株鉴定为 Delftia sp.的细菌 AN3 等^[12]。但是被研究人员选出的菌株的降解能力不尽如人意，而且除了苯胺以外需要添加其他碳氮源。此外，含苯胺的工业废水中通常含有其他相关有害物(主要为苯酚、苯等)，但现如今对含苯胺和相关有害物的污染物的降解仍需进一步研究。

1.2.2 苯胺降解菌

如今一些能降解苯胺的微生物已经被公布^[13]，如Delfria sp.，假单胞菌sp.，不动杆菌属。奥尼尔等人孤立了一个财团在油田产生的废水，在海洋泥浆中并在酸性泥炭沼泽水和土壤中发现了能够降解苯胺的微生物。 Li等人分离菌株PN1001，这是一个假单胞菌属物种，它能够降解戊胺和苯胺。制药工业中流出的苯胺废水常常是盐度升高，这可能强烈抑制的微生物增长。高废水中的盐含量可能会造成一定的影响，会导致治疗系统中的问题，特别是在生物单位。耐盐微生物，如葡萄球菌属和芽孢杆菌属是分离处理高含盐量废水。

微生物转化和降解是主要的从环境中消除苯胺的机制。假单胞菌的细菌种类，Comamonas，不动杆菌，红球菌，Fra-teuria ，Moraxella和 Nocardia显示能够降解苯胺或其衍生物。但是，还没有关于物种的报道，渴望属于Delftia 属有能力降低苯胺。高苯胺耐受性细菌是理想的环境应用以及生物转化，使苯胺及其类似物成为有用的化学物质产品。假单胞菌属被认为是最多的苯胺耐受菌株，利用浓度高达32mM。苯胺降解菌的生长和代谢会被环境直接影响，其中苯胺的浓度、培养基的温度和pH是起主要作用的,实验者可以通过分别改变苯胺的浓度、培养基的温度和pH，测定苯胺的降解情况，来判断出它生长的最适环境。因此在研究苯胺降解菌时，需要优化降解菌的生长条件，在最适生长条件下对其降解率进行测定^[14]。可以筛选受污染的土壤中的高效苯胺降解菌开展研究，讨论苯胺的浓度、培养基的温度和pH对菌体生长的影响，并且采用正交实验法确定菌株的最适生长环境。

1.3 研究意义

研究表明，微生物不仅能将水中的苯胺降解，同时还能够将残留于底泥中的

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