论文总字数：22066字

摘 要

大肠杆菌W2330能够在96孔板上发酵产L-苏氨酸。提高大肠杆菌W2330形成生物膜的能力可以使其在三角瓶中生长并且更高效的发酵产L-苏氨酸。为了实现工业化推广，本实验运用分子生物学技术，先提出大肠杆菌W2330基因组，再将csgA基因经过PCR扩增后，构建载体PET28a-csgA载体质粒，通过一步克隆技术，将csgA基因导入进大肠杆菌W2330使其过表达，成功得到大肠杆菌W2330csgA*菌种，这种菌种的生物膜产率明显提高，发酵产L-苏氨酸的能力有所增强。另外，为了得到大肠杆菌2330csgA*最适的发酵条件，本实验采用控制变量法，在探究某一发酵条件时严格控制其它变量，最后再综合各个最优的条件，以期获得最适合的发酵条件来寻求等成本下的产量最大化。选取的变量有接种量、装液量、培养温度、摇床转速。最后得到的最适发酵条件为：接种量：5%；装液量：500ml三角瓶装50ml；摇床转速：230rpm；温度：37℃。

关键词：大肠杆菌 生物膜 csgA 发酵 L-苏氨酸

Recombinant E.coli Produced Membrane and Its Effect on Fermentation and Production of Threonine

Abstract

1. coli W2330 can ferment L-threonine in a 96-well plate. The ability to increase the biofilm formation of E. coli W2330 allows it to grow in flasks and produce L-threonine more efficiently. In order to achieve industrialization, this experiment used molecular biology techniques to first propose the E. coli W2330 genome. After the PCR amplification of the csgA gene, a vector PET28a-csgA vector plasmid was constructed, and the csgA gene was introduced into E. coli via a one-step cloning technique. W2330 overexpressed it and successfully obtained E. coli strain 2330csgA*. The biofilm yield of this strain was significantly increased, and the ability to produce L-threonine was enhanced. In order to obtain the optimum fermentation conditions for E. coli 2330 csgA*, the control variable method was adopted in this experiment. Other variables were strictly controlled when a certain fermentation condition was explored. Finally, each optimal condition was synthesized to obtain the most suitable fermentation conditions to seek equal cost. The maximum output under. The selected variables include inoculation volume, liquid loading volume, culture temperature, and shaking speed. The optimum fermentation conditions obtained were: inoculation amount: 5%; liquid volume: 500 ml conical flask 100 ml; shaker rotation speed: 200 rpm; temperature: 37°C.

Key words: Escherichia coli; biofilm; csgA; fermentation; L-threonine

目录

摘要 II

Abstract III

第一章 前言 1

1.1 选题背景 1

1.2大肠杆菌 2

1.2.1 大肠杆菌简介 2

1.2.2 大肠杆菌基因的可塑造性 2

1.2.3大肠杆菌W2330的独特优势 2

1.3 生物膜 3

1.3.1 生物膜简介 3

1.3.2 生物膜的复杂多样性 4

1.3.3大肠杆菌生物膜形成的机制 5

1.4 大肠杆菌生物膜关键基因csgA 5

1.5本论文的设计思路 7

第二章 实验部分 9

2.1 药品和仪器 9

2.1.1 实验仪器 9

2.1.2 药品 9

2.2 构建大肠杆菌W2330csgA* 10

2.2.1 菌株 10

2.2.2 试剂盒 10

2.2.3 培养基 10

2.2.4 实验方法 11

2.3 重组大肠杆菌2330csgA*生物膜产率的研究 18

2.3.1 菌株 18

2.3.2 培养基 18

2.3.3 实验方法 18

2.4原始大肠杆菌W2330发酵产L-苏氨酸的条件优化 18

2.4.1菌株 18

2.4.2培养基 19

2.4.3培养方法 19

2.4.4 发酵条件选择和优化 19

2.5 原始大肠杆菌W2330和重组大肠杆菌2330csgA*发酵产L-苏氨酸的研究 20

2.5.1 菌株 20

2.5.2发酵培养基 20

2.5.3 实验方法 20

第三章 结果与讨论 23

3.1 重组大肠杆菌2330csgA*与原始大肠杆菌W2330生物膜产率对比 23

3.1.1 孔板验证 23

3.1.2 TM3000电镜 23

3.2大肠杆菌W2330最佳的发酵条件 24

3.2.1 接种量 24

3.2.2 装液量 25

3.2.3 摇床转速 26

3.2.4 培养温度 27

3.3大肠杆菌2330csgA*与原始大肠杆菌W2330产L-苏氨酸的对比 28

第四章 结论与展望 30

4.1 结论 30

4.2 展望 30

参考文献 31

致谢 33

第一章 前言

1.1 选题背景

L-苏氨酸，是一种重要的且是人体必须的氨基酸。结构式为NH₂-CH(COOH)-CHOH-CH₃,，不难发现L-苏氨酸结构式中有-OH官能团，-0H官能团有亲水作用，尤其对人的皮肤，可以起到美白保湿的效果。并且L-苏氨酸在人体中对细胞膜有保护作用，能够帮助磷酸酯更好的合成，能够促进脂肪酸的降解。L-苏氨酸的另一个十分重大的用途是作为饲料添加剂，由于动物体内不能直接合成L-苏氨酸，一般认为L-苏氨酸是动物饲料里第三、第四限制性氨基酸，市场需求十分巨大。传统的化学合成工艺步骤繁琐，产率不高，生产规模小，由于存在种种缺陷，现已经基本不再使用。运用生物发酵方法产L-苏氨酸不仅成本低廉，工艺流程简单，而且对环境污染小，可以做到大规模生产。在这样的背景下，选择合适的可发酵产L-苏氨酸的菌种进行工业化推广就具有广阔的前景。而经中科院分子改造后的大肠杆菌W2330可以在96孔板上生长，并且发酵产物是L-苏氨酸，这引起了我们课题组的兴趣，如何提高其L-苏氨酸的产率？如何优化合适的培养条件？如何进一步进行工业化推广？这些问题无疑具有十足的挑战性，同时其背后也具有巨大的商业价值。就目前对生物膜的了解来看，人们已经形成了共识，那就是微生物以生物膜的模式存在并生长，非常有利于它们适应各种复杂的环境^[1],并且容易对不良的生存环境进行感应并作出改变，生物膜是细菌的结构化社区^[2],生活在自产聚合物中坚持生存或无生命表面的基质^[3]。这样做，他们可以让生物体更能抵抗恶劣的条件，使他们能够更长久地生存和传播^[4]。可以想象，提高微生物生物膜的形成能力，可以让他们更好的生长代谢。大肠杆菌W2330野生菌可以在96孔板上成膜，且代谢产物是L-苏氨酸，通过基因改造的手段，对大肠杆菌W2330与生物膜形成相关的curli纤毛基因进行改造，可以有效的促进其以生物膜的模式生长代谢，这样就可以提高大肠杆菌W2330发酵产L-苏氨酸的产量。

大肠杆菌

1.2.1 大肠杆菌简介

大肠杆菌（Escherichia coli），也可以称为大肠埃希氏菌。一开始人们认为这是一种菌，在卫生细菌领域将其称为大肠杆菌，但其实大肠杆菌不代表某一种菌，它代表生物活性类似、与粪便污染有很大关联的一大类细菌，因为在动物和人体肠道中广泛存在，所以用大肠杆菌来命名。大肠杆菌是需氧及兼性厌氧菌，无芽孢，属于革兰氏阴性菌，周身长有鞭毛，能够运动。人体内的大肠杆菌十分奇妙，几乎每个人肠道内的菌种都不一样，这些大肠杆菌能够帮助我们消化食物，还能够帮助我们抵抗疾病。有些人吃东西能够快速消化，怎么吃都吃不胖，这就可能与他们肠道内的大肠杆菌有关系。人体内的大肠杆菌甚至能够影响人的性格，因为每个人肠道内的大肠杆菌都不一样，如果移植别人体内的大肠杆菌进入自己的体内，那么可能性格会发生变化，例如你本来是一个安静的人，移植了一个性格活泼的人大肠杆菌，你可能因此变得性格活泼。当然，这些东西有待进一步去研究。

1.2.2 大肠杆菌基因的可塑造性

大肠杆菌经常用来作为基因工程的研究对象，这与其的分子结构有很大的关系。首先大肠杆菌是遗传工程专家研究最多也最透彻的菌种，对大肠杆菌的遗传背景十分清楚，对其基因分子结构方面研究的也很透彻。大肠杆菌的基因组是在拟核当中，是一条环状的分子，没有细胞核的包被。除此之外，还有很多个环状的质粒DNA。野生型大肠杆菌DNA中很多基因位点，这些位点是重要的基因工程研究位点，基因工程专家可以根据所需要的基因位点去进行目的基因PCR过表达实验来观察最终的表现型有何变化，也可以对某些基因位点进行基因敲出实验，来观察如果缺失某个位点会有何种影响；另外，大肠杆菌是原核生物，并且没有芽孢，这些性质在做基因工程改造时会给实验带来很多很多的便利，操作可以变得非常简单。最后，大肠杆菌的发酵周期比起一般菌株更短，培养条件较为容易，对营养需求也不高，也是工业化大规模发酵的常用菌。综上可知，大肠杆菌的基因塑造性强，广受基因工程专家的亲睐。

1.2.3大肠杆菌W2330的独特优势

本实验所用的大肠杆菌W2330即是经过中科院分子改造后，可发酵直接产L-苏氨酸，并且发酵周期短，生长迅速，一般7-8个小时就可以生长到对数期。这样的大肠杆菌基因工程上进行分子改造可塑性大，方便我们通过分子改造来提高其L-苏氨酸的产率。而且由于发酵周期短，这在工业生产过程中可有效的提高生产效率，方便大规模、多批次的生产发酵L-苏氨酸，所以选用大肠杆菌W2330作为我们的研究对象具有十分广阔的前景。

1.3 生物膜

1.3.1 生物膜简介

生物膜（biofilm）的科学定义是微生物在自然界的各种不同环境中包括人体和动物表面通过黏附生长的方式并用自身分泌的细胞外基质包裹起来所形成的高度组织化的多细胞群落^[5]。生物膜是细菌的结构化社区，生活在自产聚合物中坚持生存或无生命表面的基质。这样做，他们可以让生物体更能抵抗恶劣的条件，使他们能够更长久地生存和传播。生物膜可以由单一纯种或多重种属微生物混合组成，其中含有大量的水分以及不同类型的微生物所分泌的细胞外基质，比如蛋白质，多糖，核酸等^[6]。生物膜的形成是一个动态的过程，通常包括微生物的黏附（attachment）,微菌落（microcolony）的形成,成熟（maturation）及分解（dispersion）^[7]等阶段。生物膜中的微生物有不同的发展阶段，在其发展的每一个阶段都有着着复杂的相互作用和信号之间的交流，用这种方式来调整自身的生理生化特性，从而适应生物膜形成过程中，不断变化着的外部环境因素^[8]。这些环境因素包括：营养成分，氧浓度，离子成分，代谢产物，环境温度及宿主免疫的进攻等^[9]。微生物为何要形成生物膜？目前机制尚未完全弄清楚，可能存在着很多种机制。而生物膜的形成及结构如何表现？同样令人深思。最近十几年以来来，科学家们慢慢地认识到：和单细胞浮游状态的微生物的生长模式相比，能够形成生物膜、以生物膜形式生存的微生物群体在整体上会表现出一系列新的生物学特征，同时具有更强的适应外界环境的能力^[10]。生物膜是细菌大量聚集形成的聚集体，生活在自产聚合物中坚持生存或无生命表面的基质。这样做，它们可以让生物体更能抵抗恶劣的条件，使他们能够更长久地生存和传播。这其实是导致微生物产生抗药性原因之一^[11]。科学家们现在对生物膜的形成机制及生物膜对微生物生长代谢影响也越来越重视。下图是生物膜形成过程的简图：

图1-1 生物膜的形成过程

1.3.2 生物膜的复杂多样性

微生物形成的生物膜就仿佛是一个热带雨林，是一个复杂的生态系统，其间充满着变化。生物膜内部微生物之间存在着高度的多样性和复杂的相互作用及信号交流，也就是说，生物膜内的微生物能够对自身的调控来适应环境的变化^[12]。生物膜通常由多种属的微生物和它们所分泌的细胞外基质组成。不同环境中形成的生物膜，其中的微生物的种类和细胞外基质的成分会大不相同。生物膜内的微生物组成可以是细菌，也可以是真菌以及藻类。生物膜的细胞外基质包括微生物自身分泌的有机物以及来源于外环境的已被整合进细胞外基质的无机物或有机物成分。即使是在同一类型的生物膜，微生物的组成和细胞外基质成分也会随着生物膜发展的不同时期而不断变化。生物膜内微生物细胞的生理活性，表面结构及所分泌的细胞外基质等组成成分对生物膜结构，生理，功能都有着重要的影响。铜绿假单胞菌Ⅳ型菌毛突变株，细胞外基质释放突变株都形成了与野型铜绿假单胞细菌完全不同的生物膜结构。在囊性纤维化患者的呼吸道中通常会有黏液型和非黏液型俩种不同表型的铜绿假单胞菌出现^[13]。除此之外，生物膜还具有生理多样性。随着生物膜的发展及其组成和结构的不断变化，生物膜内微生物的生理生化特性也在不断地改变以求适应环境。一个显著的例子是铜绿假单胞菌生物膜内的细菌细胞能分化成以下三种亚群：快速和慢速生长亚群，移动和非移动亚群，以及对抗生素耐药和敏感的亚群。在铜绿假单胞菌体外生物膜培养中，表层的细菌比里层的细菌有较快的生长速率，快速生长的表层细胞对抗生素环丙沙星是敏感的，而里层缓慢生长的细胞则对多黏菌素敏感^[14]。由此可见，单一抗生素对细菌生物膜的处理由于其生理的多样性而容易变得治疗效果不好或不彻底。除了细菌分化的因素外，突变也是造成生物膜内生理生化多样性的原因之一。作为一个微型生态系统，生物膜内的微生物能够快速的进化以产生具有不同功能的亚群。

1.3.3大肠杆菌生物膜形成的机制

要通过分子改造的方式来提高菌类的生物膜形成能力，首先必须了解生物膜形成的机制，非常感谢之前的微生物及医学方面的专家们，在他们的日以继夜的辛苦研究下，让我们对大肠杆菌生物膜形成的机制有了一些了解。单细胞的微生物能够互相聚集生成生物膜，与微生物分泌的一些胞外多聚物质是密切相关的，这些物质能够使细胞之间相连附着于载体上面。另外，胞外基质还可以相连成为基质网，这样的基质网可以将单细胞包在里面从而形成生物膜。与大肠杆菌生物膜形成相关的最主要的胞外物质是纤维素和Curli纤毛，纤维素和菌表Curli纤毛是一对好伙伴，他们之间可以形成密集的惰性基质网，这种基质网使得形成的生物膜在各种环境下均可以与非生物表面形成牢固的生物膜^[15]。

1.4 大肠杆菌生物膜关键基因csgA

前文已经提到，curli纤毛淀粉样蛋白纤维在大肠杆菌成膜的过程中起着重要的作用，是本实验主要的研究对象。Curli纤毛主要的结构元件是CsgA和CsgB俩种蛋白，CsgA蛋白是大亚基结构，可以在胞外环境中自由扩散。而CsgB蛋白是小亚基结构，促使了Curli纤毛在细胞外聚合，也称胞外成核^[16]。Curli纤毛就像是淀粉糊状，具有很强的吸附力，它们彼此之间连接交织形成一张密集的基质网，这样的淀粉糊状的物质很容易将细菌细胞连接起来形成生物膜，并且连接后具有一定的稳定性。Curli纤毛对大肠杆菌生物膜形成的促进作用主要体现在俩个方面：第一，淀粉糊状的Curli蛋白可以促使大肠杆菌细胞与细胞之间互相黏附，同时使细菌细胞与非生物载体表面黏附能力变强；第二，Curli还可以与宿主胞外多聚物相互作用。Curli和纤维素的协同表达受到转录调控子CsgD和含有GGDEF结构域的蛋白AdrA的调控^[17]。

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