论文总字数：16563字

摘 要

本实验目的是从双倍体酿酒酵母1308中分离单倍体菌株并测试其发酵性能。工业酿酒酵母1308中具有HO基因活性，具有转化单倍体配型的能力，并与邻近的不同单倍体配型形成异宗配合菌株，回复突变成二倍体，本实验采用同源臂敲除的方法敲去HO基因，将敲除菌接入产孢培养基培养产生孢子分离得到单倍体菌株。本文首先介绍了用于基因工程的一项操作——同源臂敲除，包括敲片各组分的制备，连接，验证，回收，采用电转的方法导入敲片；由于酿酒酵母自身同源重组率较高，敲除HO基因；将HO基因敲除转化子通过产孢，利用孢子萌发获得单倍体菌株以及做了发酵性能测试了单倍体发酵的性能。得到HO基因敲除菌株1308-ho以及单倍体菌株s1、s2，根据发酵数据发现其发酵效率不如酿酒酵母二倍体细胞。酿酒酵母单倍体的获得有利于酿酒酵母相关基因的分子改造，对研究酿酒酵母基因层面调控有重大意义。

关键词：酿酒酵母 基因敲除 单倍体分离 酒精发酵

Abstract

The purpose of this experiment was to isolate the haploid strain from diploid Saccharomyces cerevisiae 1308 and test its fermentation performance. Industrial Saccharomyces cerevisiae 1308 has HO gene activity, has the ability to transform haplotype matching, and forms heteroassociated strains with neighboring different haplotypes, and reverts to a diploid. This experiment uses homology arms. Knockout method knocks out the HO gene, and the knockout bacteria are inserted into sporulation medium to produce spores to obtain haploid strains. This article first introduced an operation used in genetic engineering—homologous arm knockout, including the preparation, connection, verification, and recovery of the components of the knock-out tablet. The knock-out was introduced using the electroporation method; due to homologous recombination of Saccharomyces cerevisiae itself. The rate is higher, and the HO gene is knocked out; the HO gene is knocked out of the transformant to produce spores, spores are used to obtain the haploid strain, and the fermentation performance is tested to test the haploid fermentation performance. The HO gene knockout strain 1308-ho and the haploid strains s1, s2 were obtained, and the fermentation efficiency was found to be inferior to that of Saccharomyces cerevisiae diploid cells based on the fermentation data. The haplotype of Saccharomyces cerevisiae is beneficial to the molecular modification of related genes of S. cerevisiae, which is of great significance for the study of gene regulation of Saccharomyces cerevisiae.

Key Words：Saccharomyces cerevisiae；Gene knockout；Haploid isolation；Alcoholic fermentation

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 酿酒酵母简介及发展背景 1

1.2 酿酒酵母单倍体制备的意义 1

1.3 酿酒酵母产孢机理 2

1.4 酿酒酵母的酒精发酵 2

1.5 酿酒酵母的接合型转化 3

1.6 基因敲除以及PCR技术的简介 3

1.7 论文的主要研究内容 4

第二章 酿酒酵母HO基因的敲除 6

2.1 前言 6

2.2 材料与方法 6

2.2.1 菌株和培养 6

2.2.2 试剂和仪器 6

2.2.3 敲片的制备 7

2.2.4 HO基因的敲除 10

2.3 结果与讨论 12

2.3.1 抗性G418浓度的选取 12

2.3.2 敲片的验证及连接方法的改良 12

2.3.3 抗性板菌落验证 13

2.3.4 转接培养后PCR验证结果 13

第三章 酿酒酵母单倍体的分离及发酵性能测试 14

3.1 前言 14

3.2 材料与方法 14

3.2.1 菌株和培养 14

3.2.2 试剂和仪器 15

3.2.3 产孢率的计算 16

3.2.4 子囊孢子镜检 16

3.2.5 孢子的释放 17

3.2.6 酿酒酵母单倍体的分离与验证 17

3.2.7 酿酒酵母单倍体发酵性能的测定 17

3.3 结果与讨论 18

3.3.1 酿酒酵母单倍体孢子的镜检观察 18

3.3.2 酿酒酵母产孢率随时间变化的记录 18

3.3.3 子囊孢子破壁情况的观察 19

3.3.4 单倍体酿酒酵母的鉴定 21

3.3.5 酿酒酵母单倍体发酵性能测定结果 21

第四章 结论与展望 26

4.1 结论 26

4.2 展望 26

参考文献 27

致谢 29

文献综述

酿酒酵母简介及发展背景

酿酒酵母^[1]又称出芽酵母，其细胞的形态为球形或卵形，表面湿润且平坦，多为淡棕色，直径5-10μm，以出芽的方式进行繁殖，在真菌生长受限的条件中，真菌采用有性生殖方式产生孢子的方法传代，并等待条件相宜的情况下实现成长和繁衍，不同配型的孢子二者结合形成一个全新的个体，实行常规的生理活动，利用出芽模式进行后代的繁衍。酿酒酵母对人类起着至关重要的作用，除了由于它应用于各种食品的发酵和酿酒，在微生物学以及分子生物学的领域中作为一种真核模式生物^[2]。酿酒酵母有着较厚的细胞壁，较高的固醇含量，能够耐受酒精和一些木质纤维素水解物的毒性。酿酒酵母产乙醇的机制是将葡萄糖等各种单糖转移进入细胞，在缺氧或无氧的条件下，经过细胞内某种特定的酶的作用，将葡萄糖等单糖分解为酒精 ^[3]。酿酒酵母可以在酸性和缺氧或无氧条件下发酵出产酒精，且过程不容易引入其他细菌和病毒，较少副产物。

目前，国内外均通过基因工程改造酿酒酵母，以提升酿酒酵母的发酵能力，酿酒酵母传统的菌种挑选和革新的方法主要有杂交育种、突变筛选和诱变育种，以上方法几乎都是采用大规模育种的方式，在较大的范围或整个基因组区域内使其基因发生重组，可能在优化酿酒酵母菌某些特性的同时，丧失一些自身优良的特征，所以这些方法的特异性不够强。而近年来基因工程技术的逐渐发展起来了，这提高了在选育改良酿酒酵母上的方法的专一性，在消除不利于实验研究的基因表达、引入利于实验研究的特性的同时，还不影响其他性状^[4]。

酿酒酵母单倍体制备的意义

酿酒酵母的二倍体细胞比单倍体细胞更具优势， 二倍体细胞在大多数情况下体积较大，对不良环境的抵抗力较强，具有较好的生长发酵性能。而单倍体细胞在不良环境下具有较高的死亡率，但单倍体只含一个易于遗传修改的等位基因，且转化后的表型变化易于观察。此外，酿酒酵母存在两个等位基因，基因改造所用的同源重组方法很难同时改造一对等位基因，只改造一个等位基因的情况下，在生长繁殖和后期发酵的过程中容易发生回复突变^[5]。通过物理化学诱变方法得到的只是显性突变菌，而忽略了许多隐形突变^[6]。二倍体不具有挑选标记，没有办法进行直接的遗传操作，对二倍体酵母进行基因改造的基础操作是分离出单倍体菌株，二倍体形态是酿酒酵母菌主要的营养细胞，能通过相关条件诱导得到子囊孢子，由孢子萌发得到酿酒酵母单倍体细胞。为了制备和研究具有双亲优良性状的工业高产酿酒酵母，最有效的举措是将分离出的酿酒酵母单倍体作为亲本，产生更加高产稳定的双倍体后代，是酵母菌细胞原生质体融合的育种新技术，增强了融合子的稳定性^[7]，改善了工业酿酒酵母的功效和特征，提升了工业酿酒酵母的生产水准。因此，在实施酿酒酵母基因改造前，需要从它的双倍体中分离出易于基因改造而不易发生回复突变的单倍体孢子。

酿酒酵母产孢机理

交配型基因座杂合的酿酒酵母细胞可以以各种方式适应环境的营养状态的变化，一些营养限制可能导致细胞进入稳定期，培养基中N源的缺乏与不可发酵的C源的存在共同致使二倍体细胞在进入减数分裂^[8]，形成含有四个孢子的子囊^[9]的发育途径。酿酒酵母中储备的氮化物经N循环提供了培养基中的氮源，当不可发酵的C源是醋酸盐时，还能促使孢子成长，其能源由少许的葡萄糖提供。孢子的形成需要经过一个特殊的细胞分裂过程，在母细胞的细胞质内形成了子细胞^[8]。

酿酒酵母的酒精发酵

如今，世界上各国主要使用淀粉作为生产乙醇的原料，然而淀粉这种物质不能直接被酿酒酵母使用，而酿酒酵母也没有可以实现淀粉分解的淀粉酶，所以淀粉在烦琐的糖化水解过程后变成单糖后才能为酿酒酵母所直接使用。酿酒酵母发酵生产乙醇是一个系统过程，生产时间长，工艺流程复杂，其中任意一个小的环节都有可能影响乙醇的产量^[10]。

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