论文总字数：17601字

摘 要

甲醛是一种性质活泼的有机物，对人体健康有巨大的危害。生物降解法凭借其低污染、低成本、高效率的优势成为甲醛污染治理的热点。微生物中存在以甲醛脱氢酶为关键酶的甲醛代谢途径。现筛选出来源于热脱氮地芽孢杆菌的甲醛脱氢酶ALDH，构建重组质粒pET-22b-ALDH在Escherichia coli BL21（DE3）中稳定表达，然后对该甲醛脱氢酶进行了酶学性质鉴定，并使用阴离子DEAE交换柱将蛋白进行纯化。结果表明，该甲醛脱氢酶对高温和偏碱环境的耐受性较好。该酶的最适pH为8.0，最适反应温度为70℃；在pH 10.5的室温条件下，1 h后剩余酶活达到96%；在室温条件下，50℃保温1 h剩余酶活为50%。Ca² 、Ba² 和Cu² 离子对该酶的活性有明显促进作用，而Li 、Mg² 和EDTA则对其有不同程度抑制作用，其它金属离子对该酶活性几乎没有影响。

关键词：甲醛脱氢酶 热脱氮地芽孢杆菌 基因克隆 表达 酶学性质

Cloning and Expression of Aldehyde dehydrogenase from Geobacillus thermodenitrificans subsp. thermodenitrificans

Abstract

Formaldehyde is a potent toxic and carcinogenic compound for organism. Biological treatment method has become a research hotspot as it has great advantages in terms of low cost, low pollution and high catalysis efficiency. Formaldehyde dehydrogenase is the key enzyme in formaldehyde metabolic pathway in microorganism. In this paper, the formaldehyde dehydrogenase gene is obtained from Geobacillus thermodenitrificans subsp. Thermodenitrificans, and the recombinant plasmid pET-22b-ALDH is constructed after gene amplification. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) to induce expression of target protein, and the protein was purified by anion Exchange column DEAE and then its enzymatic properties were identified. The results showed that the formaldehyde dehydrogenase had high tolerance towards temperature and alkali environment. The optimum pH for the enzyme was 8.0 and the optimum reaction temperature was 70 ℃. The enzyme activity remained 96% under the pH 10.5 at room temperature for 1 h, and resting enzyme activity at room temperature was 50% after 1 h under 50℃. Ca² , Ba² and Cu² had a significantly positive effect on the enzyme activity while Li , Mg² and EDTA inhibited it to different degrees. Other metal ions have little influence on the enzyme activity.

Key Words: Aldehyde dehydrogenase; Geobacillus thermodenitrificans subsp. thermodenitrificans; Gene cloning; Expression; Enzyme properties

目 录

摘 要 II

目 录 II

第一章 文献综述 4

1.1 甲醛的性质及危害 4

1.2 甲醛污染的治理方法 4

1.2.1 物理吸附法 4

1.2.2 化学反应法 5

1.2.3 生物处理法 5

1.3 甲醛脱氢酶简介 6

1.4 本课题的研究意义及研究内容 7

第二章 材料与方法 8

2.1 实验材料 8

2.1.1 实验仪器 8

2.1.2 实验试剂 9

2.1.3 菌株与质粒 9

2.1.4 培养基及培养条件 10

2.2 实验方法 11

2.2.1甲醛脱氢酶基因的克隆和表达 11

2.2.2 甲醛脱氢酶的酶活测定 13

2.2.3 甲醛脱氢酶的酶学性质研究 14

2.2.4 甲醛脱氢酶的分离纯化 14

第三章 结果与讨论 15

3.1 甲醛脱氢酶基因在Escherichia coli中的克隆和表达 15

3.1.1 重组质粒和菌株的构建 15

3.1.2 重组质粒pET-22b-ALDH的诱导表达 16

3.2 甲醛脱氢酶的酶活测定 17

3.2.1 蛋白浓度测定标准曲线 17

3.2.2 甲醛脱氢酶的酶活测定 17

3.3 甲醛脱氢酶的酶学性质研究 17

3.3.1 最适pH和pH稳定性 17

3.3.2 最适温度和温度稳定性 18

3.3.3 金属离子和EDTA对甲醛脱氢酶活性的影响 19

3.4 甲醛脱氢酶的分离纯化 20

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 23

参考文献 24

致谢 27

文献综述

• 1. 甲醛的性质及危害

甲醛，又名“蚁醛”，是最简单的醛类物质[1]。在常温下，甲醛是一种无色、有强烈刺激性气味的气体[1]。由于甲醛结构中含有羰基氧原子和α-氢原子，性质较为活泼，能与DNA、蛋白质和脂类产生非特异性的反应[1]，所以甲醛对所有的生物体都有很强的细胞毒性和致癌性[2]。

甲醛的危害体现在以下三个方面：

1. 强刺激性。甲醛是许多皮肤疾病的发病诱因，因为人体鼻子、眼睛和呼吸道对甲醛的刺激性较为敏感[3]。尽管对甲醛的耐受有一定个体差异，但是一般情况下，持续30 min接触4.8~6.0 mg/m³甲醛就会使人出现眼痒，流泪，咽痛，以及咽痒等症状[3]；甲醛浓度达到12~24 mg/m³时，接触人群会出现咳嗽、头痛甚至呼吸困难的症状；甲醛浓度≥ 60 mg/m³时，可引起肺水肿、肺炎等，甚至死亡[3]。

（2）免疫毒性。甲醛对细胞有毒性，对动物和人体的免疫系统有抑制和毒害作用，会导致肝、肾功异常，免疫力降低等。经常接触甲醛的人群患呼吸道疾病（如哮喘病）的概率较高，研究认为，这类疾病的发生与甲醛所引起的人体免疫功能紊乱有关。

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